在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物的制作方法

在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了具有改善的溶解性和/或半衰期而仍然保持胰高血糖素激动剂活性的修饰的胰高血糖素肽。通过将原始氨基酸替换为带电的氨基酸和/或向肽的羧基末端添加带电的氨基酸对胰高血糖素肽进行修饰。可以通过聚乙二醇化或通过添加选自SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23的羧基末端肽或通过这二者对修饰的胰高血糖素激动剂进行进一步修饰，以进一步增强胰高血糖素激动剂类似物的溶解性。
【专利说明】在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的膜高血 糖轰类似物
[0001] 本申请是申请日为2009年6月16日、发明名称为"在生理抑缓冲液中具有增强 的溶解性和稳定性的膜高血糖素类似物"、申请号为200980127066. 4的发明专利申请的分 案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求下列优先权；2008年6月17日提交的美国临时专利申请号 61/073, 193, 2008年7月3日提交的美国临时专利申请号61/078, 165和2008年8月20日 提交的美国临时专利申请号61/090, 415。每个申请的公开内容均明确地通过引用的方式全 文并入本文。

【技术领域】
[0004] 本发明涉及在生理抑缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的膜高血糖素类似 物。

【背景技术】
[0005] 前膜高血糖素原（pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肤，其在不同组 织中被处理W形成多个不同的膜高血糖素原衍生的肤，包括膜高血糖素、膜高血糖素样 肤-l(GLP-l)、膜高血糖素样肤-2(GLP-1)和胃泌酸调节素（0XM)，它们参与众多生理学功 能，包括葡萄糖体内平衡、膜岛素分泌、胃排空和肠生长，W及食物摄入的调节。膜高血糖素 是29个氨基酸的肤，其对应于前膜高血糖素原的氨基酸33至61，而GLP-1作为37个氨基 酸的肤产生，其对应于前膜高血糖素原的氨基酸72至108。
[0006] 当血糖水平降得太低W致于不能为身体活动提供足够能量时，发生低血糖症。在 成人或10岁W上的儿童中，低血糖症较不常见，除非是作为糖尿病治疗的副作用，但是它 可W来源于其它药物治疗或疾病、激素或酶缺乏、或肿瘤。当血糖开始下降时，由膜腺产生 的激素膜高血糖素向肝脏发出信号，使肝脏分解肝糖原并释放葡萄糖，使血糖水平朝着正 常水平升高。因此，普遍认为膜高血糖素在葡萄糖调节中的作用是抵消膜岛素的作用并维 持血糖水平。但是对于糖尿病而言，该种针对低血糖症的膜高血糖素响应可能被破坏，使葡 萄糖水平难W恢复至正常范围。
[0007] 低血糖症是威胁生命的事件，其需要立即进行医疗关注。给予膜高血糖素是已经 建立起来的治疗急性低血糖症的药物治疗，它可W在给药数分钟内恢复葡萄糖的正常水 平。当膜高血糖素用于低血糖症的急性医疗处理时，将晶体形式的膜高血糖素溶解于弱酸 缓冲液，并通过肌肉内注射该溶液。虽然该治疗是有效的，但方法很麻烦，且对于某些半昏 迷状态的人员有危险。因此，需要该样一种膜高血糖素类似物，其保持母体分子的生物学表 现但在相关的生理条件下具有足够的溶解性和稳定性，从而其可W预先配制为即用型注射 溶液。
[0008] 另外，鼓励糖尿病患者维持接近正常的血糖水平W延迟或预防微血管并发症。该 目标的实现通常需要强化膜岛素治疗。在努力达到该目标的过程中，医生曾遇到过他们的 糖尿病患者中的低血糖症的频率和严重性显著升高的问题。因此，需要改善的药物和方法 来治疗糖尿病，所述药物和方法相对于目前的膜岛素治疗而言，较不容易诱导低血糖症。
[0009] 如本文所述，提供了高效力的膜高血糖素激动剂，其在适合商用的药物组合物中 在生理pH时具有升高的生物物理稳定性和水溶性。原始膜高血糖素在生理pH范围内既不 可溶也不稳定，因此，其必须作为干燥产品生产，需要复原和立即使用。本文描述的膜高血 糖素类似物具有增强的物理性质，该使其特别适合用于目前应用原始激素的目前的医疗环 境中。根据一个实施方式，该些化合物可W用于制备用于治疗低血糖症的预先配制的即用 型注射溶液。或者，膜高血糖素激动剂可W与膜岛素一起给药W缓冲膜岛素的效应，W便允 许更稳定地维持血糖水平。另外，下文详细描述了包含本文公开的修饰的膜高血糖素肤的 组合物的其它有益用途。


【发明内容】

[0010] 本发明的一个实施方式提供了膜高血糖素肤，其保持膜高血糖素受体的活性并相 对于原始膜高血糖素肤（SEQ ID NO: 1)表现出改善的溶解性。原始膜高血糖素在水溶液中， 特别是在生理抑时溶解性差，倾向于随时间发生聚集和沉淀。相反，相对于原始膜高血糖 素，本发明的一个实施方式的膜高血糖素肤在25°C在6-8的抑，或6-9的抑，例如在抑为 7时，在24小时后表现出至少2倍、5倍或更高的溶解性。
[0011] 在一个实施方式中，膜高血糖素肤保持原始膜高血糖素的至少10 %、20 %、30 %、 40 %、50 %、60 %、70 %、75 %的活性、80 %的活性、85 %的活性、或90 %的活性（按照膜高血 糖素肤的EC50相对于膜高血糖素的EC50的反比计算，例如使用大体上如实施例13中描述 的测定法通过cAMP的产生来测定）。在一个实施方式中，本发明的膜高血糖素肤具有等于 或大于膜高血糖素的活性（与本文的"效力"一词同义使用）。在一些实施方式中，膜高血 糖素肤保持多达约100 %、1000 %、10, 000%、100, 000 %或1，000, 000 %的原始膜高血糖素 活性。
[0012] 膜高血糖素通常具有大约1 %的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性。GLP-1 (7-36) 醜胺（SEQ ID N0:57)或GLP-U7-37)酸（SEQ ID N0:58)是化P-1的生物学有效形式，它 们在GLP-1受体上具有基本上相同的活性。相对于GLP-1受体，膜高血糖素对于膜高血糖 素受体也具有10至20倍高的选择性（选择性按照膜高血糖素对于膜高血糖素受体的EC50 相对于膜高血糖素对于GLP-1受体的EC50的反比计算）。例如，在某测定中，膜高血糖素对 于膜高血糖素受体的EC50是0. 22nM并且膜高血糖素对于化P-1受体的EC50是3. 85nM，贝。 计算的选择性是17. 5倍。可W通过例如使用大体上如实施例13描述的测定法通过cAMP 的产生来测定活性。在一些实施方式中，本发明的膜高血糖素肤表现出小于大约5%、4%、 3%、2%或1%的原始化P-1在化P-1受体上的活性，和/或相对于化P-1受体而言，其对 于膜高血糖素受体的选择性是大于约5倍、10倍、或15倍。例如，在一些实施方式中，本发 明的膜高血糖素肤表现出小于5%的原始GLP-1在GLP-1受体上的活性，并且相对于GLP-1 受体而言，其表现出对于膜高血糖素受体的大于5倍的选择性。
[0013] 本发明的任何膜高血糖素肤还可能另外表现出改善的稳定性和/或减少的降解， 例如，在25°C在24小时后保持至少95%的初始肤。在一些实施方式中，本发明的膜高血糖 素肤表现出改善的稳定性，从而在至少2(TC (例如2rc、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、至 少27. 5°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少50°C ) W及小于l〇〇°C、小于85°C、小于 75°C，小于或70°C的温度，在溶液中1周或更长时间（例如，2周、4周、1个月、2个月、4个 月、6个月、8个月、10个月、12个月）之后，通过紫外线扣V)检测器在280nm可W检测到 至少75 % (例如至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、大于95 %，直至100 % )浓度 的肤，或者小于大约25% (例如，小于20%、小于15%、小于10%，小于5%、4%、3%、2%、 1%、直至0% )的降解的肤。
[0014] 根据一个实施方式，提供了具有改善的溶解性的膜高血糖素肤，其中通过氨基酸 替换和/或添加对所述肤进行修饰，所述氨基酸替换和/或添加向所述肤的C-末端部分引 入带电的氨基酸，在一个实施方式中，是在SEQ ID NO: 1的位置27的C-末端的位置。任选 地，可W在C-末端部分引入1个、2个或3个带电的氨基酸，在一个实施方式中，是在（相对 于）位置27的C-末端。根据一个实施方式，位置28和/或29的原始氨基酸被替换为带 电的氨基酸，和/或1至3个带电的氨基酸被添加到肤的C-末端，在位置29之后。在示例 性实施方式中，所述带电的氨基酸中的1个、2个或全部是带负电的。可W对膜高血糖素肤 进行另外的仍允许它保留膜高血糖素活性的修饰，例如保守性替换。
[0015] 根据一个示例性实施方式，膜高血糖素肤包含SEQ ID N0:11的氨基酸序列，或其 类似物，所述类似物相对于原始膜高血糖素含有1至3个另外的氨基酸修饰，或它的膜高血 糖素肤激动剂类似物。SEQ ID NO: 11代表修饰的膜高血糖素肤，其中原始蛋白的位置28 的天冬醜胺残基替换为天冬氨酸。在另一个示例性实施方式中，膜高血糖素肤包含SEQ ID N0:38的氨基酸序列，其中原始蛋白的位置28的天冬醜胺残基替换为谷氨酸。其它示例性 实施方式包括SEQ ID側:24、25、26、33、35、36和37的膜高血糖素肤。
[0016] 根据另一个实施方式，提供了在膜高血糖素受体上具有增强的效力的膜高血糖素 肤，其中所述肤包含在原始膜高血糖素（SEQ ID NO: 1)位置16上的氨基酸修饰。通过非限 制性举例方式，该样的增强的效力可W通过W下列氨基酸替换位置16的天然存在的丝氨 酸来提供：谷氨酸或其它带负电的具有4个原子长度的侧链的氨基酸，或谷氨醜胺、高谷氨 酸或高半脫氨酸中的任一个，或具有包含至少一个杂原子（例如N、0、S、巧的侧链和具有 大约4个（或3-5个）原子长度的侧链的带电的氨基酸。W谷氨酸替换位置16的丝氨酸 使膜高血糖素在膜高血糖素受体上的活性增强至少2倍、4倍、5倍、直至大于10倍。在一 些实施方式中，相对于GLP-1受体，膜高血糖素肤保持对于膜高血糖素受体的选择性，例如 至少5倍、10倍、或15倍的选择性。
[0017] 可W通过向肤连接亲水性部分进一步改善前述任意化合物的溶解性。引入该样的 基团还会延长作用时间，例如，按照循环中的延长的半衰期来度量。在一个实施方式中，亲 水性部分是聚己二醇（阳G)链或其它水溶性聚合物，其共价连接至所述膜高血糖素肤的位 置16、17、21、24、29、40上的一个或多个氨基酸残基、C-末端延伸内的氨基酸残基或C-末 端氨基酸的侧链。在一些实施方式中，在该位置的原始氨基酸替换为具有适合与亲水性部 分交联的侧链的氨基酸，W促进亲水性部分与肤的连接。示例性的氨基酸包括切S、Lys、 化n、高半脫氨酸或己醜基苯丙氨酸（Ac-Phe)。在其它实施方式中，在C-末端向肤添加经 修饰为包含亲水性基团的氨基酸。根据一个实施方式的聚己二醇链的分子量介于大约500 至大约40, 000道尔顿的范围。在一个实施方式中，聚己二醇链的分子量介于大约500至大 约5, 000道尔顿的范围。在一个另实施方式中，聚己二醇链的分子量介于大约10, 000至大 约20, 000道尔顿。在其它示例性实施方式中，聚己二醇链的分子量介于大约20, 000至大 约40, 000道尔顿。
[0018] 根据一些实施方式，本文公开的膜高血糖素肤被修饰为包含醜基或焼基，例如对 于天然存在的氨基酸而言不是原始的（non-native)醜基或焼基。醜基化或焼基化可W增 加循环中的膜高血糖素肤的半衰期，可W有利地延迟在膜高血糖素和/或GLP-1受体上的 作用起始和/或延长作用的持续时间，和/或提高对诸如DPP-IV的蛋白酶的抗性。醜基化 或焼基化还可W增强肤在中性抑的溶解性。如本文所示，醜基化之后，维持了（如果没增 强）膜高血糖素肤在膜高血糖素受体和GLP-1受体上的活性。
[0019] 在一些方面，膜高血糖素肤通过间隔子共价连接到醜基或焼基，所述间隔子是例 如氨基酸、二肤、H肤、亲水性双官能间隔子或疏水性双官能间隔子。在一些方面，在通过间 隔子使肤醜基化之后，观察到在GLP-1和膜高血糖素受体上的活性增强。在选择的方面，诸 女口，例如，当肤缺少分子内桥（例如，共价分子内桥）的时候，相对于那些其中醜基不通过间 隔子连接到肤上的醜基化的肤而言，在通过间隔子使肤醜基化之后，观察到在GLP-1和膜 高血糖素受体上的活性的进一步增强。根据一些实施方式，间隔子是氨基酸或具有长度为 3至10个原子（例如6至10个原子）的氨基酸或肤骨架结构的二肤。根据一些具体实施 方式，间隔子和醜基或焼基的总长度是14至28个原子，例如17至28个，19至26个原子， 19至21个原子。用于增强膜高血糖素活性目的的合适的间隔子在本文中另有详细描述。 在一些实施方式中，本文描述的的醜基化或焼基化的肤还包含选择性地降低在GLP-1受体 上的活性的修饰，例如位置7的Thr的修饰，例如W缺少轻基的氨基酸如氨基下酸（Abu)或 lie替换位置7的化r ;删除在位置27或28的氨基酸的C-末端的（一个或多个）氨基酸 (例如删除位置28和29的氨基酸中的一个或两个），从而产生长度为27或28个氨基酸的 肤。
[0020] 可W在亲水性部分连接的相同氨基酸位置或在不同的氨基酸位置进行膜高血糖 素肤的醜基化或焼基化。
[0021] 在一些实施方式中，本发明提供了修饰为包含共价连接至膜高血糖素肤的位置10 的氨基酸的醜基或焼基的膜高血糖素肤。膜高血糖素肤还可W在膜高血糖素肤的位置10 的氨基酸和醜基或焼基之间包含间隔子。在一些实施方式中，所述醜基是脂肪酸或胆汁酸 或其盐，例如C4至C30脂肪酸、C8至C24脂肪酸、胆酸、C4至C30焼基、C8至C24焼基、或 包含胆汁酸的留（steroid)部分的焼基。间隔子是具有结合醜基或焼基的适当的反应性基 团的任意部分。在示例性的实施方式中，间隔子包含氨基酸、二肤、H肤、亲水性双官能间隔 子例如氨基聚（焼氧基）駿酸基团（amino poly (alkylo巧)carbo巧late),或疏水性双官 能间隔子。在一些实施方式中，间隔子选自Trp、Glu、Asp、切S和包含NH2(CH2CH2〇)n(CH2) mCOOH的间隔子，其中m是1至6的任意整数，n是2至12的任意整数。该样的醜基化或焼 基化的膜高血糖素肤还可W包含亲水性部分，任选为聚己二醇。前述任意膜高血糖素肤可 W包含两个醜基或两个焼基，或其组合。
[0022] 本发明还包括所述膜高血糖素激动剂的药学上可接受的盐。
[0023] 在其它示例性实施方式中，可W通过向膜高血糖素肤的駿基末端添加第二个肤而 对任意前述化合物进行进一步修饰W改变其药学特性。在一个实施方式中，膜高血糖素肤 通过肤键共价结合至第二个肤，其中所述第二个肤包含选自SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21 和SEQ ID NO:22的序列。
[0024] 在一些实施方式中，位置1或2的修饰可W增加肤对二肤基肤酶IV值PP IV)切割 的抗性。例如，位置2的氨基酸可W替换为D-丝氨酸、D-丙氨酸、额氨酸、甘氨酸、N-甲基 丝氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基异下酸。或者或另外，位置1的氨基酸可W替换为D-组氨酸 值-His)、去氨基组氨酸（desaminohistidine)、轻基-组氨酸、己醜基-组氨酸、高组氨酸、 N-甲基组氨酸、a -甲基组氨酸、咪哇己酸、或a，a -二甲基咪哇己酸值MIA)。
[0025] 观察到位置2的修饰（例如位置2的AIB) W及在一些情况下位置1的修饰（例 如位置1的DMIA)可降低膜高血糖素活性，有时显著降低；令人惊奇的是，膜高血糖素活性 的该种降低可W通过膜高血糖素的C-末端部分（大约是氨基酸12-29)中的a-螺旋结 构的稳定化得W恢复。在一些实施方式中，稳定化是通过位置"i"和"i+4"的氨基酸之间 的共价键实现的，其中i是12至25的任意整数。在一些【具体实施方式】中，"i"和"i+4"是 12和16,16和20,或，20和24,或，24和28。在一些实施方式中，该共价键是位置16的谷 氨酸和位置20的赖氨酸之间的内醜胺桥。在示例性实施方式中，桥或接头的长度是大约8 个（或大约7-9个）原子。在其它实施方式中，稳定化是通过位置"j"和"j+3"的氨基酸 之间的共价键实现的，其中j是12至27的任意整数。在示例性实施方式中，桥或接头的长 度是大约6个（或大约5-7个）原子。在其它实施方式中，稳定化是通过位置"k"和"k+7" 的氨基酸之间的共价键实现的，其中k是12至22的任意整数。在一些实施方式中，该共价 键是分子内桥而非内醜胺桥。例如，合适的形成共价键的方法（即形成共价分子内桥的方 法）包括下列的任一个或多个；帰姪复分解（olefin metathesis)、基于羊毛硫氨酸的环化、 二硫桥或修饰的含硫桥的形成、使用a, 二氨基焼姪系绳（diaminoa化ane tethers)、 金属-原子桥的形成和其它的肤环化方式。
[0026] 在其它实施方式中，通过非共价键（即非共价的分子内桥）使螺旋稳定化，包括但 不限于氨键、离子相互作用和盐桥。
[0027] 在本发明的其它实施方式中，膜高血糖素肤的C-末端部分（大约是氨基酸 12-29)中的a-螺旋结构的稳定化通过在保持想要的活性的位置上故意引入一个或多个 a, a-双取代氨基酸来实现。在一些实施方式中，膜高血糖素肤的位置16、17、18、19、20、 21、24或29中的1个、2个、3个、4个或更多个被a, a-双取代氨基酸替换。例如，W氨基 异下酸（AIB)替换膜高血糖素肤的位置16提供了不存在盐桥或内醜胺时的稳定的a-螺 旋。该样的肤在本文中被认为是不含分子内桥的肤。在具体的方面，通过引入一个或多个 a，a-双取代氨基酸而不引入共价的分子内桥例如内醜胺桥、二硫桥来实现a-螺旋的稳 定化。该样的肤在本文中被认为是不含共价的分子内桥的肤。在一些实施方式中，位置16、 20、21或24中的1个、2个、3个、或更多个被AIB替换。
[0028] 因此，在一些实施方式中，本发明提供了具有膜高血糖素激动剂活性的膜高血糖 素肤，其包含W下氨基酸序列：
[0029] Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Tii)-Leu-Met-Z(SEQ ID N0:39)，其中具有 1 至 3 个氨基酸修 饰，
[0030] 其中XI和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低膜高血糖素肤对二肤基 肤酶IV值PP-IV)切割的敏感性（或增加对其的抗性），
[0031] 其中Z选自-C00H(天然存在的C-末端駿酸基团）、-Asn-C00H、Asn-Thr-C00H和 Y-C00H，其中Y是1至2个氨基酸，并且，
[0032] 其中分子内桥，优选共价键，将位置i的氨基酸和位置i+4的氨基酸的侧链连接起 来，其中i是12、16、20或24。
[003引在一些实施方式中，分子内桥是内醜胺桥。在一些实施方式中，SEQ ID N0:39的 位置i和i+4的氨基酸是Lys和Glu，例如Glul6和Lys20。在一些实施方式中，XI选自 D-His、N-甲基-His、a -甲基-His、咪哇己酸、去氨基-His、轻基-His、己醜基-His、高组 氨酸和a, a-二甲基咪哇己酸值MIA)。在其它实施方式中，X2选自D-Ser、D-Ala、Gly、 N-甲基-Ser、Val和a氨基异了酸（AIB)。在一些实施方式中，膜高血糖素肤在氨基酸位 置16、17、20、21、24、29、40中的任意位置、C-末端延伸内或C-末端氨基酸共价连接至亲水 性部分。在示例性实施方式中，该亲水性部分共价连接至该些位置中的任意位置上的Lys、 切S、化n、高半脫氨酸或己醜基苯丙氨酸残基。示例性的亲水性部分包括聚己二醇（PEG)，例 女口，分子量为大约1，000道尔顿至大约40, 000道尔顿，或大约20, 000道尔顿至大约40, 000 道尔顿。
[0034] 在其它实施方式中，本发明提供了具有膜高血糖素激动剂活性的膜高血糖素肤， 其包含W下氨基酸序列：
[0035] Xl-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg -Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-hp-Leu-Met-ZGEQ ID N0:39),
[0036] 其中XI和/或X2是非原始氨基酸，该非原始氨基酸降低膜高血糖素肤对二肤基 肤酶IV值PP-IV)切割的敏感性（或增加对其的抗性），
[0037] 其中膜高血糖素肤的位置16、20、21和24中的1个、2个、3个、4个或更多个被 a，a-双取代氨基酸替换，并且
[0038] 其中Z选自-C00H(天然存在的C-末端駿酸基团）、-Asn-C00H、Asn-Thr-C00H和 Y-C00H，其中Y是1至2个氨基酸。
[0039] 前述膜高血糖素肤或类似物的示例性的另外的氨基酸修饰包括：位置7的T虹替 换为缺少轻基的氨基酸例如Abu或lie,任选地，所述替换与包含共价连接至（任选地，通过 间隔子）醜基或焼基（其中所述醜基或焼基对于天然存在的氨基酸而言不是原始的）的侧 链的氨基酸的替换或添加相联合，位置12的Lys被Arg替换；位置15的Asp被Glu替换； 位置16的Ser被T虹或AIB替换；位置20的Gin被Ser、化r、Ala或AIB替换；位置21的 Asp被Glu替换；位置24的Gin被Ser、!'虹、Ala或AIB替换；位置27的Met被Leu或Nle 替换；位置28的Asn被带电的氨基酸替换；位置28的Asn被选自Lys、Arg、化s、Asp、Glu、 半脫氨酸和高半脫氨酸的带电的氨基酸替换；位置28被Asn、Asp或Glu替换；位置28被 Asp替换；位置28被Glu替换；位置29的T虹被带电的氨基酸替换；位置29的T虹被选自 Lys、Arg、化3、439、6111、半脫氨酸和高半脫氨酸的带电的氨基酸替换；位置29被439、6111或 Lys替换；位置29被Glu替换；在位置29之后插入1-3个带电的氨基酸；在位置30 (即在 位置29之后）插入Glu或Lys ;任选地在位置31插入Lys ;向C-末端添加SEQ ID NO: 20， 任选地，其中位置29的氨基酸是T虹或Gly ;替换为或添加共价连接至亲水性部分的氨基 酸；或其组合。
[0040] 在另一个示例性实施方式中，可W通过修饰SEQ ID NO: 1的位置15的氨基酸对前 述任意的肤进行进一步修饰W改善稳定性，W便减少该肤随时间的降解，特别是在酸性或 碱性缓冲剂中的降解。在示例性的实施方式中，位置15的Asp替换为谷氨酸、高谷氨酸、半 脫氨酸或高半脫氨酸。
[0041] 或者，可W通过修饰SEQ ID NO: 1的位置16的氨基酸对本文描述的任意膜高血糖 素肤进行进一步修饰W改善稳定性。在示例性的实施方式中，位置16的Ser替换为T虹或 AIB，或者上文描述的增强在膜高血糖素受体上的效力的任意氨基酸替换。该样的修饰减少 Aspl5-Serl6之间的肤键的切割。
[0042] 在膜高血糖素受体上的维持的或增强的活性可W通过W谷氨醜胺类似物修饰位 置3的Gin来实现。例如，在位置3包含谷氨醜胺类似物的膜高血糖素肤可W显示出原始 膜高血糖素（例如SEQ ID NO: 1)在膜高血糖素受体上的大约5%、大约10%、大约20%、大 约50 %或大约85 %或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨醜胺类似物的膜 高血糖素肤可W显示出相应的膜高血糖素肤（其与包含谷氨醜胺类似物的肤具有相同的 氨基酸序列，除了位置3的修饰的氨基酸之外）（例如SEQ ID N0:69或SEQ ID N0:70)在 膜高血糖素受体上的大约20 %、大约50 %、大约75 %、大约100 %、大约200 %或大约500 % 或更高的活性。在一些实施方式中，在位置3包含谷氨醜胺类似物的膜高血糖素肤表现出 在膜高血糖素受体上的增强的活性，但该增强的活性不超过原始膜高血糖素或相应的膜高 血糖素肤（其与包含谷氨醜胺类似物的肤具有相同的氨基酸序列，除了位置3的修饰的氨 基酸之外）的活性的 1000%、10, 000%、100, 000%或 1，000, 000%。
[0043] 在一些实施方式中，所述谷氨醜胺类似物是天然存在的或非天然存在的包含结构 I、II或III的侧链的氨基酸：
[0044]

【权利要求】
1. 一种肽，其包括： (i)氨基酸序列 HSQGTFTSDYSKYLDAibRRAQDFVQWLMDE (SEQ IDNO: 76)或（ii) 具有1个、2个或3个修饰的EQ ID NO: 76， 其中所述肽包括在位置16的AIB、在位置28的Asp和在位置29的Glu且所述肽展示 胰高血糖素激动剂活性。
2. 权利要求1的肽，其中所述肽的位置1的氨基酸是D-组氨酸（D-His)、去氨基组氨 酸、羟基-组氨酸、乙酰基-组氨酸、高组氨酸、N-甲基组氨酸、a -甲基组氨酸、咪唑乙酸或 a，a -二甲基咪唑乙酸（DMIA)。
3. 权利要求1的肽，其中所述肽的位置2的氨基酸是D-丝氨酸、D-丙氨酸、缬氨酸、甘 氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基丙氨酸或氨基异丁酸（AIB)。
4. 权利要求3的肽，其中位置2的氨基酸是D-丝氨酸或AIB。
5. 权利要求1的肽，其中位置20的氨基酸是是Ala、Ser或Thr。
6. 权利要求1的肽，其中位置24的氨基酸是Ala、Ser或Thr。
7. 权利要求1的肽，其包括氨基酸序列SEQ ID NO: 68。
8. 包含通过接头连接的两个肽的二聚体，其中所述两个肽中至少一个是权利要求1-7 中任一项的肽。
9. 权利要求8的二聚体，其中所述二聚体是同型二聚体。
10. -种缀合物，其包含缀合部分和权利要求1-7中任一项的肽，任选地，其中所述缀 合部分是多肽、祀向试剂、诊断标记、聚合物或糖。
11. 权利要求10的缀合物，其中所述缀合部分是多肽且所述多肽是异源肽、免疫球蛋 白或其部分。
12. -种融合肽，其由融合至包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20的肽的权利要求1或7中 任一项的肽组成。
13. -种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的肽和药学上可接受的载体。
14. 一种药物组合物，其包含权利要求8的二聚体和药学上可接受的载体。
15. -种药物组合物，其包含权利要求10的缀合物和药学上可接受的载体。
16. -种药物组合物，其包含权利要求12的融合肽和药学上可接受的载体。
17. -种用于向有需要的患者给予胰高血糖素激动剂的药盒，所述药盒包括权利要求 13的药物组合物和用于给予患者所述药物组合物的装置。
18. 权利要求17的药盒，其中所述装置包括注射器和针，其中所述药物组合物预先包 装在所述注射器内。
19. 权利要求1-7中任一项的肽或包含所述肽的二聚体、缀合物、融合肽或其组合在制 备用于在有需要的患者中引起肠道的暂时性麻痹、在有需要的患者中减少体重增加或引起 体重下降、在有需要的患者中治疗或预防低血糖症或在有需要的患者中稳定血糖水平的药 物中的用途。
20. 权利要求19的用途，其中所述药物用于稳定血糖水平并与胰岛素联用。
【文档编号】A61P3/10GK104447980SQ201410562514
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2009年6月16日 优先权日:2008年6月17日
【发明者】R.D.迪马基, D.L.斯米利, M.迪马基, J.沙贝内, J.戴 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司