一种淡菜甾体活性组分提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种淡菜甾体活性组分提取物及其制备方法和应用。

背景技术：
据最新统计数据显示，全世界60岁及以上老龄人口在2013年已达8.14亿，预计到2050年这个数字将超过20亿。世界已进入老龄化社会，随之而来的与衰老相关的疾病成为日益凸显的问题。包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病是世界性的最严峻的公共卫生难题之一。仅在中国，阿尔茨海默病的患者数量在1990年已有193万，到2010年已增加至569万。在医药学领域，寻找抗衰老及治疗神经退行性疾病的药物已成为急需解决的问题。如公开号为CN102070695A的中国专利文献公开了一种麦角甾醇衍生物，该麦角甾醇衍生物提取自中药灵芝孢子粉；研究发现，在抗衰老化合物的体外筛选模型中，该麦角甾醇衍生物可以显著延长酵母细胞的复制性寿命。经过对衰老机制的长期研究，本领域内已形成多种衰老学说，包括程序衰老说、体细胞突变说、错误成灾说，自由基说、神经内分泌说、免疫衰老说、细胞之学说，等等。由此可见，衰老是一个十分复杂的过程，即便是同一类抗衰老药物，其发挥药效的方式也不尽相同，彼此之间无必然联系。海洋生物由于生活在特殊的环境中，与陆地生物相比，结构成分也具有特殊性，近年来成为新药研究者的主要研究对象。并且我国的海洋资源丰富，继中药之后，海产品是另一个药物资源宝库。许多已上市的化妆品、保健品的功能性成分就来自于海产品，如胶原蛋白，二十二碳六烯酸(DHA)等。因此海产品为我们寻找抗衰老药物提供了一个极具希望的新 领域。淡菜是贻贝(Mytilidae)肉的干制品。贻贝是驰名中外的海产食品之一，是贝类养殖事业中的重要种类，世界许多地区都有养殖。它的药用价值也已有研究：一种治疗耳鸣的中药处方中就含有淡菜；淡菜中的寡肽对于老年性脑功能失调具有治疗作用；淡菜所含的多级不饱和脂肪酸可预防心血管疾病；脂质类提取物具有抗关节炎的作用。而目前关于淡菜的抗衰老活性还未见报道。

技术实现要素：
本发明提供了一种淡菜甾体活性组分提取物，该提取物具有较强的抗衰老效果。一种淡菜甾体活性组分提取物，以重量百分数计，包括：25～39％的胆固醇，19～27％的菜子固醇，12～25％的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇，12～25％的24-亚甲基胆固醇。上述四种甾醇化合物的结构式分别为：其中，胆固醇(cholesterol)的理化性质为：白色固体；分子式为C27H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z409.345,理论值：C27H46ONa(M+Na)+409.344.；1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.86(d,3H,J＝2.0Hz),0.87(d,3H,J＝2.0Hz),0.92(d,3H,J＝6.5Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.36(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.5,21.2,22.7,23.0,24.0,24.5,28.1,28.4,31.8,32.1,32.1, 35.9,36.3,36.7,37.4,39.7,39.9,42.5,42.5,50.3,56.3,56.9,72.0,122.2,141.1.菜子固醇(brassicasterol)，系统命名为(22E,24R)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇，其理化性质为：白色固体；分子式为C28H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z421.345,理论值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.5Hz),0.83(d,3H,J＝6.5Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.01(s,3H),1.01(d,3H,J＝6.5Hz),3.52(m,1H),5.18(m,2H),5.34(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,17.8,19.6,19.8,20.1,21.1,21.2,24.4,28.7,29.9,31.8,32.1,33.3,36.7,37.4,39.8,40.3,42.4,42.5,43.0,50.3,56.2,57.0,72.0,121.9,131.9,136.0,140.9.(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇(crinosterol)的理化性质为：白色固体；分子式为C28H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z421.345,理论值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3):δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.8Hz),0.84(d,3H,J＝6.8Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.00(d,3H,J＝6.9Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.16(m,2H),5.35(m,1H).13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,18.2,19.6,19.8,20.3,21.2,21.2,24.5,29.0,29.9,31.9,32.1,33.4,36.7,37.4,39.9,40.4,42.4,42.5,43.2,50.3,56.1,57.1,72.0,121.9,132.0,136.2,141.0.24-亚甲基胆固醇(24-methylenecholesterol)，系统命名为麦角甾-5，24-(28)-二烯-3β-醇，其理化性质为：白色固体；分子式为C28H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z421.344,理论值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.95(d,3H,J＝6.6Hz),1.01(s,3H),1.02(d,3H,J＝6.9Hz),1.03(d,3H,J＝6.9Hz),3.53(m,1H),4.66(s,1H),4.71(s,1H),5.35(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.6,21.3,22.0,22.2,24.5,28.4,29.9,31.2,31.9,32.1,34.0,34.9,35.9,36.7,37.4,40.0,42.5,42.5,50.3,56.2,56.9,72.0,106.1,121.9,140.9,157.1。作为优选，以重量百分数计，所述淡菜甾体活性组分提取物包括：27％的胆固醇，19％的菜子固醇，12％的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇，12％的24-亚甲基胆固醇。本发明还提供了所述淡菜甾体活性组分提取物的制备方法，包括：(1)将淡菜置于甲醇中浸提，得浸提物；作为优选，将淡菜置于甲醇中，室温下浸提2～3天。甲醇的破壁效果较好，提取效率较高。(2)用80％的甲醇水溶液和正己烷对浸提物进行萃取，取正己烷层，得粗提物；(3)对粗提物进行分离纯化，获得所述淡菜甾体活性组分提取物。所述分离纯化包括以下步骤：(a)以正己烷：乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱对粗提物进行第一次分离，获得目标馏分；对粗提物进行TLC分析，确定溶剂系统，优选地，将正己烷：乙酸乙酯溶剂系统按体积比99:1、98:2、97:3、96:4、90:10、0:100依次洗脱，体积比90:10洗脱的馏分为目标馏分。(b)以甲醇：水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对所述目标馏分进行第二次分离，获得所述淡菜甾体活性组分提取物。对所述目标馏分进行TLC分析，确定溶剂系统，优选地，将甲醇：水溶剂系统按照体积比90:10，93:7，95:5，100:0依次洗脱，取体积比95：5洗脱的馏分，获得所述淡菜甾体活性组分提取物。以90％甲醇水溶液作流动相，利用反相HPLC对所述淡菜甾体活性组分提取物作进一步纯化，从中分离到胆固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇和24-亚甲基胆固醇这四种甾醇化合物，在淡菜甾体活性组分提取物中，这四种甾醇化合物的总含量大于50％。本发明还提供了所述淡菜甾体活性组分提取物在制备抗衰老药物中的应用。研究发现，该淡菜甾体活性组分提取物在抗衰老化合物的体外筛选模型中，可以显著延长酵母细胞的复制性寿命。为了研究作用机制，我们通过占重量比最大的胆固醇进行了抗衰老机理研究，发现胆固醇是通过调节UTH1基因、SOD基因的表达，减少活性氧自由基(ROS)和丙二醛 (MDA)的产生，提高抗氧化能力，从而实现酵母细胞复制性寿命的延长的。根据氧化自由基学说，氧化压力是导致衰老的主要原因。即使在正常条件下线粒体也会产生有害的代谢产物—活性氧(ROS)，这些物质会破坏细胞膜和生物大分子，例如蛋白和核酸，进而破坏细胞的功能，引起衰老和死亡。除此之外，活性氧还可通过氧化不饱和脂肪酸产生有害物来破坏细胞破，比如丙二醛。UTH1是一个与氧化应激相关的基因。UTH1敲除后的酵母不仅能显著延长其在营养缺乏时的寿命，还能增强其对过氧化物的耐受性。转录因子Skn7能够感受氧化压力，进而激活下游的与氧化应激相关的基因。本发明发现，胆固醇的抗衰老活性与基因UTH1，Skn7相关。SOD也是与氧化应激相关的基因，表达的超氧化物歧化酶能够清除氧自由基，缓解氧化压力。本发明发现，胆固醇的抗衰老活性也与基因SOD相关。本发明还提供了一种抗衰老药物或保健品，由所述淡菜甾体活性组分提取物和药学上可接受的载体组成。所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。所述填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。所述抗衰老药物或保健品的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。本发明的抗衰老药物或保健品可通过各种途径给予，包括口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。与现有技术相比，本发明的有益效果为：在酵母衰老模型K6001啤酒酵母细胞中，本发明的淡菜甾体活性组分 提取物能够显著延长酵母细胞的复制性寿命，该组合物的抗衰老活性均高于胆固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇和24-亚甲基胆固醇这四种甾醇化合物单独的抗衰老活性；本发明对延缓衰老及治疗衰老性疾病方面的新药研发进行基础性研究，具有重要的现实意义。附图说明图1A为从淡菜中分离获得的四种甾醇化合物的结构式；其中，cholesterol表示胆固醇，brassicasterol表示菜子固醇，crinosterol表示(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇，24-methylenecholesterol表示24-亚甲基胆固醇，下同；图1B为本发明淡菜甾体活性组分提取物(SF)对酵母k6001的复制性寿命的影响结果；其中，Control为阴性对照，Resveratrol为白藜芦醇，SF是由淡菜分离得到的活性组分，经HPLC纯化得到Cholesterol,Brassicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol四个甾醇类化合物，其中的Cholesterol,Brassicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol的重量百分数分别是27％，19％，12％，12％(四个化合物重量比例为23:16:10:10)，还含有30％的其他成分,下同；图1C为四种甾醇化合物对酵母细胞的复制性寿命的影响结果；图2为不同比例的甾醇成分所组成的混合物对酵母复制性寿命的影响。混合物1和混合物2完全由Cholesterol,Brassicasterol,Crinosterol和24-Methylenecholesterol搭配组成，重量比例分别为23:16:10:10和1:1:1:1；图3A为胆固醇对酵母突变菌株Δuth1复制性寿命的影响结果；其中，CHOL表示胆固醇，下同；图3B为胆固醇对酵母突变菌株Δskn7复制性寿命的影响结果；图3C为胆固醇对酵母突变菌株Δsod1复制性寿命的影响结果；图3D为胆固醇对酵母突变菌株Δsod2复制性寿命的影响结果；图4A为胆固醇对酵母细胞抗氧化性能的影响结果；图4B为在氧压下胆固醇对酵母细胞生存率的影响结果；图5A为胆固醇对酵母细胞内ROS含量的影响结果；其中，Fluorescent/107cell表示每107个细胞的荧光值；图5B为胆固醇对酵母细胞内MDA含量的影响结果；其中，MDA(nmol/mgprotein)表示丙二醛(Malondialdehyde)的含量，单位为纳摩尔/毫克蛋白。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。实施例1淡菜甾体活性组分提取物的制备本实施例淡菜甾体活性组分提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)将179g淡菜干货置于1L甲醇(工业级)中，室温下浸提3天(震荡)；经抽滤浓缩后，得到甲醇浸提物。(2)用80％的甲醇水溶液和正己烷萃取分离，静置过夜，将正己烷层减压浓缩旋干后，得到正己烷层粗样4g。(3)将正己烷层粗样用硅胶开口柱进行分离(200-300目)，以正己烷∶乙酸乙酯溶剂系统作洗脱剂，按正己烷∶乙酸乙酯的体积比＝99:1，98:2，97:3，96:4，90:10，0:100依次洗脱，取体积比90:10洗脱的馏分。(4)将步骤(3)所取馏分用ODS开口柱进行纯化，以甲醇∶水溶剂系统作洗脱剂，按甲醇∶水的体积比＝90∶10，93∶7，95∶5，100∶0依次洗脱，取体积比95:5洗脱的馏分，得到淡菜甾体活性组分提取物147mg。(5)取淡菜甾体活性组分提取物16.7mg用反向HPLC纯化，色谱条件：色谱柱ODS-HG-5(10/250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为为甲醇∶水＝90∶10，得到化合物cholesterol(胆固醇，4.5mg，保留时间为160.9min)，brassicasterol(菜子固醇，3.2mg，保留时间为146.7min)，crinosterol((22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇，2.0mg，保留时间为136.9min)，24-methylenecholesterol(24-亚甲基胆固醇，2.0mg，保留时间为124.0min)。本实施例淡菜甾体活性组分提取物中含有27％的胆固醇，19％的菜子固醇，12％的(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇，12％的24-亚甲基胆固醇。(6)对所得四种化合物的理化特征及化学结构经13CNMR、1HNMR、HRMS、[α]D进行分析结果如下：胆固醇的理化性质：白色固体；分子式为C27H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z409.345,理论值：C27H46ONa(M+Na)+409.344.；1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.86(d,3H,J＝2.0Hz),0.87(d,3H,J＝2.0Hz),0.92(d,3H,J＝6.5Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.36(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.5,21.2,22.7,23.0,24.0,24.5,28.1,28.4,31.8,32.1,32.1,35.9,36.3,36.7,37.4,39.7,39.9,42.5,42.5,50.3,56.3,56.9,72.0,122.2,141.1。菜子固醇的理化性质：白色固体；分子式为C28H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z421.345,理论值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.5Hz),0.83(d,3H,J＝6.5Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.01(s,3H),1.01(d,3H,J＝6.5Hz),3.52(m,1H),5.18(m,2H),5.34(m,1H)。13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,17.8,19.6,19.8,20.1,21.1,21.2,24.4,28.7,29.9,31.8,32.1,33.3,36.7,37.4,39.8,40.3,42.4,42.5,43.0,50.3,56.2,57.0,72.0,121.9,131.9,136.0,140.9。(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇的理化性质：白色固体；分子式为C28H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z421.345,理论值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3):δ＝0.69(s,3H),0.82(d,3H,J＝6.8Hz),0.84(d,3H,J＝6.8Hz),0.91(d,3H,J＝6.8Hz),1.00(d,3H,J＝6.9Hz),1.01(s,3H),3.52(m,1H),5.16(m,2H),5.35(m,1H).13CNMR(125MHz,CDCl3):δ＝12.2,18.2,19.6,19.8,20.3,21.2,21.2,24.5,29.0,29.9,31.9,32.1,33.4,36.7,37.4,39.9,40.4,42.4,42.5,43.2,50.3,56.1,57.1,72.0,121.9,132.0,136.2,141.0。24-亚甲基胆固醇的理化性质：白色固体；分子式为C28H46O；高分辨率质谱ESI-TOF-MSm/z421.344,理论值：C28H46ONa(M+Na)+421.344.1HNMR(500MHz,CDCl3)：δ＝0.68(s,3H),0.95(d,3H,J＝6.6Hz),1.01(s,3H),1.02(d,3H,J＝6.9Hz),1.03(d,3H,J＝6.9Hz),3.53(m,1H),4.66(s,1H),4.71(s,1H),5.35(m,1H)。13CNMR(125 MHz,CDCl3):δ＝12.0,18.9,19.6,21.3,22.0,22.2,24.5,28.4,29.9,31.2,31.9,32.1,34.0,34.9,35.9,36.7,37.4,40.0,42.5,42.5,50.3,56.2,56.9,72.0,106.1,121.9,140.9,157.1。四种化合物的结构式如图1A所示。实施例2淡菜甾体活性组分提取物的抗衰老活性分析目前用于抗衰老研究的生物模型主要有老鼠，线虫，果蝇和酵母。本实施例选择酿酒酵母作为抗衰老研究的活性系统，因为酵母是单细胞的真核生物，生命周期短，已获其完整的基因组数据，是目前常用的衰老模型生物。同时以白藜芦醇作为阳性对照，白藜芦醇是目前众所周知的、在多种动物模型上显示抗衰老作用的小分子化合物。分析方法包括以下步骤：(1)从-30℃冰箱取出K6001酵母菌株，用PBS洗涤三次，每次5ml，除去其中的甘油。最后加入1mlPBS，吹打，使其悬浮后加入到5ml液体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中。28℃振摇(160r/min)培养48小时。(2)培养结束后用5mlPBS洗涤三次，除去其中的液体培养基，用血球计数板计数，计算酵母的浓度。(3)采用无水乙醇作溶剂，分别配制0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL的淡菜甾体活性组分提取物，1μM的胆固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇、24-亚甲基胆固醇，10μM的白藜芦醇，备用。(4)在灭过菌的培养皿中加入5ml的固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的琼脂粉)，待培养基凝固后，向其中分别加入步骤(3)中配制好的样品，溶剂挥发后加入4000个酵母，用涂布器涂抹均匀，28℃恒温培养48小时。(5)显微镜下每皿随机数出40个母细胞分别产生的子细胞个数，并记录、作图分析，结果见图1B、图1C。图1B中，阴性对照的K6001的平均寿命为8.0±0.34，阳性对照(10μM的白藜芦醇)是9.7±0.53**；0.1、0.3、1μg/mL浓度的淡菜甾体活性组分提取物(SF)分别是10.3±0.46***,10.2±0.56**,9.2±0.43*。因 此，SF能延长酵母的复制性寿命，且在低浓度下活性最好。在图1C中，阴性对照的K6001的平均寿命为是8.0±0.43；阳性对照是9.7±0.44**；在1μM的浓度下，胆固醇、菜子固醇、(22E,24S)-麦角甾-5,22-二烯-3β-醇、24-亚甲基胆固醇分别是9.9±0.47**,9.9±0.47**，10.0±0.46**，9.8±0.43**。(*p<0.01，**p<0.01和***p<0.001表明有显著性差异)。说明四个化合物在1μM均能显著延长酵母的复制性寿命，且程度几乎相同。对图1B、C的结果的比较，发现SF在浓度为0.1μg/ml时比其中的任何一个单独化合物(最佳浓度1μM，相当于约0.4μg/ml)的抗衰老活性强。实施例3不同组成的淡菜甾体活性组分提取物的抗衰老活性分析测试表1中不同组成的淡菜甾体活性组分提取物对酵母复制性寿命的影响，分析方法同实施例2，分析结果见图2。表1三种淡菜甾体活性组分提取物的组成成分由图2可见，阴性对照组酵母的平均寿命是8.1±0.43；阳性对照是10.6±0.52***；SF(即实施例1获得的淡菜甾体活性组分提取物)(0.1μg/ml)是10.4±0.51***；混合物1(0.07μg/mL)是10.5±0.53***；混合物2(0.07μg/mL)是10.0±0.54**(**p<0.01和***p<0.001表明有显著性差异)。对图2的结果分析发现当四个甾醇化合物以与SF中相同比例混合时 (混合物1)，抗衰老活性与SF几乎相同，表明SF中起到抗衰老作用的成分主要是这四种甾醇化合物，其他物质的抗衰老活性较低；当改变这四种甾醇化合物的比例时(混合物2)，仍然有显著抗衰老活性，但与SF相比，活性强度稍减。说明四个甾醇化合物在SF的抗衰老活性中共同起着重要的作用，比例的改变影响较小。实施例4胆固醇的抗衰老机制分析(1)测试胆固醇在1μM的活性浓度下是否能够延长敲除了UTH1基因的K6001酵母突变菌株(Δuth1)的复制性寿命，分析方法同实施例2，分析结果见图3A。(2)测试胆固醇在1μM的活性浓度下是否能够延长敲除了Skn7基因的K6001酵母突变菌株(Δskn7)的复制性寿命，分析方法同实施例2，分析结果见图3B。(3)测试胆固醇在1μM的活性浓度下是否能够延长敲除了SOD1基因的K6001酵母突变菌株(Δsod1)的复制性寿命，分析方法同实施例2，分析结果见图3C。(4)测试胆固醇在1μM的活性浓度下是否能够延长敲除了SOD2基因的K6001酵母突变菌株(Δsod2)的复制性寿命，分析方法同实施例2，分析结果见图3D。由图3A和3B可见，1μM的胆固醇能延长K6001的复制性寿命，但却不能延长Δuth1和Δskn7的复制性寿命，说明胆固醇通过调节基因UTH1，Skn7的表达延长酵母细胞的复制性寿命。由图3C和3D可见，1μM的胆固醇能延长K6001的复制性寿命，但却不能延长Δsod1和Δsod2的复制性寿命，说明胆固醇的抗衰老活性与SOD基因有关。实施例5胆固醇提高酵母生存率的活性分析测试胆固醇能否提高酵母的生存率，测试方法如下：(1)将-30℃保存的野生型酵母BY4741用5mlPBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml葡萄糖培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；将其放入摇床，28℃振摇 (160r/min)培养48小时，使其恢复生长能力。(2)将BY4741接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD600值为0.1，然后分别与1μM、3μM的胆固醇和阳性对照品(10μM的根皮苷，Phloridzin)孵育12小时。(3)取各组含有相同酵母细胞的培养液5μL滴在含有9mMH2O2的葡萄糖固体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％琼脂)上；28℃培养4天后观察酵母的生长状况并照相，观察结果见图4A；或者，BY4741与胆固醇孵育12小时后，取每组约200个细胞分别涂在含有和不含有4mMH2O2的葡萄糖固体培养基上；28℃培养2天后计算酵母细胞生存率；酵母细胞生存率(％)＝(含4mMH2O2的葡萄糖固体培养基上的酵母菌落数/不含H2O2的葡萄糖固体培养基上的酵母菌落数)×100％；计算结果见图4B。由图4A可见，与阴性对照相比，在含有9mMH2O2的葡萄糖固体培养基上，1μM、3μM的胆固醇明显增加了酵母的生存率。由图4B可见，阴性对照的酵母细胞生存率为51.0％±0.8％，1μM、3μM的胆固醇孵育下，酵母细胞生存率分别提高到了60.6％±2.1％(p<0.01)和68.4％±1.9％(p<0.001)，而10μM的根皮苷孵育下，酵母细胞生存率提高到了61.5％±2.9％(p<0.01)。表明与根皮苷相比，胆固醇能够进一步提高酵母的生存率。实施例6胆固醇的抗氧化活性分析测试胆固醇能否提高酵母细胞的抗氧化能力，测试方法如下：将-30℃保存的K6001酵母菌株用5mlPBS洗涤三次，除去其中的甘油；加入1ml无菌水，吹打使其悬浮，加入到5ml液体培养基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中；将其放入摇床，28℃振摇(160r/min)培养48小时，使其恢复生长能力；然后将K6001接种到25mL新的葡萄糖培养基，调整OD600值为0.1，然后分别与1μM、3μM的胆固醇孵育23小时，测定ROS或MDA含量。其中，使用ROS试剂盒(南京，江苏，碧云天)和酶标仪测定ROS 含量：取1mL酵母培养液，加入10μMDCFH-DA，置于摇床(160r/min)28℃黑暗培养1小时，每15分钟涡旋震荡，使酵母细胞与DCFH-DA充分混匀；然后用PBS洗涤细胞后将酵母加入到96孔板，测荧光值(激发波长488nm，吸收波长525nm)；用血球计数板测定酵母浓度最后计算出一定数量的酵母细胞产生的荧光值。并与对照组比较；测定结果见图5A。MDA的测定：酵母细胞与样品孵育23小时后，加入8mMH2O2氧化刺激，维持一小时；之后收集各组的所有细胞并用PBS洗三次；然后加500μLPBS使酵母悬浮并通过超声裂解(每次1分钟，5次)使细胞破碎；4℃条件下离心(12000r/min，15min)得到上清裂解液。利用MDA试剂盒测定每组的MDA含量；测定结果见图5B。由图5A可见，1μM、3μM的胆固醇降低了ROS的水平(p<0.01，p<0.05)；由图5B可见，1μM、3μM的胆固醇降低了MDA的产量(p<0.01，p<0.05)。表明胆固醇能提高酵母细胞的抗氧化性，从而降低氧自由基产生的有害代谢产物。