一种疫苗组合物、试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明属于兽药领域，具体涉及一种含有犬副流感病毒抗原及犬支气管败血波氏杆菌抗原的疫苗组合物，试剂盒，以及其制备方法和应用。

背景技术：

犬传染性支气管炎(canineinfectioustracheobronchitis,itb)又称犬窝咳(kennelcough)，是犬的一种急性高度接触性呼吸道传染病，具有高传染性、危害严重、影响范围广、易引发其他高致死性病原体感染等特点，仅在甘肃省2004-2009年的调查中该病的整体发病率高达34.26％(卢旺银.甘肃省犬窝咳的流行病学调查与防治.畜牧兽医杂志,2010,29(3):49-52)。该病主要引起幼犬突发性阵发性咳嗽并伴有不定量的鼻腔分泌物，常于春秋季节多发，由于犬群中一旦发病，很快引起整窝幼犬发病、咳嗽，故被称为“犬窝咳”。目前，普遍认为该病主要是由犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)、犬支气管败血波氏杆菌(caninebordetellabronchiseptica，或bordetellabronchisepticaindogs,bb)病原定殖在鼻腔、喉、气管、支气管等部位而引起(ettinger,stephenj.,feldman,edwardc.texkbookofveterinaryinternalmedicine(4^thedition).1995,wbsaunderscompany)。

cpiv属于副粘液病毒亚科副粘病毒属，是单股负链rna病毒，可感染各种年龄、性别的犬科动物，特别是幼龄犬，主要通过病犬的眼分泌物、唾液、呼吸道分泌物等散播，经呼吸道途径感染，通过损坏犬的上呼吸道组织，引起干咳、尖咳、鼻塞等症状，严重者会引起犬的支气管炎和支气管肺炎，并给其它病原体的感染创造条件。

bb为波氏杆菌属成员之一，为一种革兰氏阴性、需氧球杆菌，是在 患有支气管炎的犬中最常分离出的细菌，易感染不同品种、年龄、性别的犬科动物，尤其易感4-12周龄犬，并且已有文献报道该细菌可由犬传染给其他种类动物如猫(dwightch,nigeljm,richardlw,etal.veterinarymicrobiology(2^ndedition).2004,blackwellpublishing)。该菌潜伏期有2-14日，如不与其他病原体共同感染作用，此菌的临床症状通常会持续10日，然而即使感染症状已消失，但此细菌可继续在自然环境中生存6-14周，期间可再传染至易感动物。此菌通过鼻液、唾液、呼吸道分泌物等传播，可通过直接或间接接触感染。此菌感染的临床症状包括黏液鼻塞、深咳、尖咳、干咳、不适，在运动或情绪激动时会加重。若感染第二病毒原体，经常会引起严重支气管肺炎。

国内家庭饲养宠物的数量与日俱增，据不完全统计我国目前仅宠物犬的数量已超过1.5亿只，在许多经济发达城市的宠物数量与居民比例为1:10。因此，对宠物的健康要求越来越高。由于现有疫苗保护率不高，免疫效果不理想，究其原因是因为个别疫苗毒种的免疫原性不强，有的甚至存在毒性恢复、毒力返强、副反应等现象(见中国专利cn103153337a、cn1876181a)。因此，急需研制更为安全有效的抗犬窝咳的疫苗制品。

专利申请cn102343088a公开了一种犬传染性气管支气管炎二联活疫苗及其制备方法，利用分离得到的有较好免疫原性的犬副流感病毒及犬支气管败血波氏菌，纯化后进行传代致弱，获得弱毒株cpiv-cy-c株与菌株bb-sd25d，作为生产用毒株，制备出二联活疫苗。然而其存在毒性恢复、毒力返强的危险。

专利申请cn101035558a公开了对抗布拉迪斯拉发钩端螺旋体和其他病原体的多联犬疫苗，含犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白与其他多种犬病毒的联苗。然而该发明针对犬多种疾病，不能针对犬窝咳(2种疾病)进行针对性治疗。

技术实现要素：

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种疫苗组合物及其制 备方法和应用，该疫苗组合物可以预防和/或治疗犬窝咳。

本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫有效量的犬副流感病毒抗原及免疫有效量的犬支气管败血波氏杆菌抗原以及兽医学上可接受的载体；其中，所述犬副流感病毒抗原选自灭活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原选自灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原或p68蛋白。

本发明另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒含有犬副流感病毒抗原及犬支气管败血波氏杆菌抗原以及佐剂；其中，所述犬副流感病毒抗原为灭活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为减毒的活的犬支气管败血波氏杆菌抗原；或所述犬副流感病毒抗原为减毒的活的犬副流感病毒抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原或p68蛋白。

本发明另一方面涉及本发明的疫苗组合物的制备方法。

本发明另一方面涉及本发明的试剂盒的制备方法。

本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬传染性支气管炎的药物中的应用。

本发明还涉及所述的试剂盒在制备预防和/或治疗犬传染性支气管炎的药物中的应用。

本发明所述疫苗组合物免疫后无副反应发生，且免疫效果优于现有二联活疫苗；且本发明疫苗组合物免疫后无发喷嚏、咳嗽、流鼻涕等临床症状，从而避免了将病原暴露给兽医工作者或接触者的可能，并降低了犬传染性支气管炎的发病率。

具体实施方式

以下说明本发明的实施方式。

本发明主要涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫有效量的犬副流感病毒抗原及免疫有效量的犬支气管败血波氏杆菌抗原 以及兽医学上可接受的载体；其中，所述犬副流感病毒抗原选自灭活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原选自灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原或p68蛋白。

术语“疫苗组合物”又称免疫原性组合物，是指一种含免疫原的制剂，包括如蛋白质、肽、全细胞、灭活的、亚单位或减毒的活的病毒或细菌，或者多糖，或其组合，其被施用来刺激受体对存在于免疫原性组合物中一种或多种抗原的体液和细胞免疫反应。免疫接种是施用疫苗组合物并在宿主中刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程。优选的宿主为哺乳动物诸如犬。

术语“免疫有效量”又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“犬副流感病毒抗原”是指至少含有一种犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)抗原形式的任何组合物，所述犬副流感病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬副流感病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬副流感病毒抗原包括活的抗原如cy-c株(保藏号为cgmccno.5268，参见中国专利cn102343088a)，a-20/8株(参见中国专利cn1876181a)，xn-4株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病 毒弱毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):722-724)，solvary株(金昌德，李六金，娄庆林等.犬副流感流行毒株的分离鉴定.中国畜禽传染病,1997(1):24-27)，以kc-plus呈现的活减毒犬副流感病毒d008株、以canixindhppi/l呈现的活减毒犬副流感病毒manhattan株、以duramunedappi呈现的活减毒犬副流感病毒fdl株、以vanguard7呈现的活减毒犬副流感病毒nl-cpi-5株、以和/或kc呈现的活减毒犬副流感病毒cornell株，以吉林省五星动物保健药厂生产的犬五联活疫苗的犬副流感病毒a-20/8株，和/或来自naramune^tm、univac2、univac5、kennel-jec^tm、plus5的活减毒的犬副流感病毒毒株；灭活的抗原如犬副流感病毒d008株(美国atcc保存，保藏号为vr-399)，xn931株(金昌德，李六金，施新猷等.犬副流感病毒流行毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):719-721)，xn934株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):722-724)，78238株(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主编.兽医微生物学.北京:中国农业出版社,1998:414-415)、yz0506株(岑皓.犬副流感病毒的分离及单克隆抗体的制备.扬州大学硕士学位论文,2007)；亚单位抗原如含犬副流感病毒免疫原性蛋白f(fusionprotein，即融合蛋白)、hn(hemagglutinin-neuraminidase，即血凝素神经氨酸酶)、m(matrixprotein，即基质蛋白)、np(nucleocapsidprotein，即核衣壳蛋白)、p(phosphopritein，即磷蛋白)和/或l(largeprotein，即大蛋白)蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。

术语“结构域”是指蛋白质生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100-400个之间，最小的结构域只有40-50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原选自灭活的犬副流感病毒抗原d008株抗原、以及f蛋 白、hn蛋白、np蛋白中的至少一种；所述犬支气管败血波氏菌抗原选自灭活的犬支气管败血波氏菌d-2株抗原、以及p68蛋白。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原为灭活的犬副流感病毒抗原d008株抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的犬支气管败血波氏杆菌d-2株抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原为犬副流感病毒f蛋白、hn蛋白、np蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的支气管败血波氏菌d-2株抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原为灭活的犬副流感病毒抗原d008株抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为p68蛋白。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原为犬副流感病毒f蛋白、hn蛋白、np蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为p68蛋白。

术语“f蛋白”(fusionprotein)为犬副流感病毒的融合蛋白，其分子量为51kd，所述f蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的登录号为ay491509.1、ef546392.1、ef487542.1、ax586947.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1的f蛋白基因序列。

术语“hn蛋白”(hemagglutinin-neuraminidase)为犬副流感病毒的血凝素神经氨酸酶，其分子量为68kd，所述hn蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的登录号为ef543647.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、ef546393.1的hn蛋白基因序列。

术语“np蛋白”(nucleocapsidprotein)又称n蛋白，为犬副流感病毒的核衣壳蛋白，分子量为60kd，所述np蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的登录号为ef543648.1、ef546391.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、 ay581307.1的np蛋白基因序列。

术语“犬支气管败血波氏杆菌抗原”又称犬支气管败血波氏菌抗原、犬波氏杆菌抗原或犬支气管炎博德特氏菌(caninebordetellabronchiseptica，canineb.bronchiseptica，或bordetellabronchisepticaindogs，bb)抗原，是指至少含有一种犬支气管败血波氏杆菌抗原形式的任何组合物，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原可诱导、刺激或抵抗犬支气管败血波氏杆菌感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原、或其细菌提取物。所述犬支气管败血波氏杆菌抗原包括活的抗原如sd25d株(保藏号为cgmccno.5292，参见中国专利cn102343088a)、以kc-plus呈现的活减毒犬支气管败血波氏杆菌菌株s-55、以bronchi-shield呈现的活减毒犬支气管败血波氏杆菌菌株92b、以和/或kc呈现的活减毒犬支气管败血波氏杆菌菌株b-c2，和/或来自naramune^tm、univac2和/或kennel-jec^tm的活犬支气管败血波氏杆菌菌株；灭活的抗原如d-2株、bb7株、bi33irp274株(jacobsaac,theelenrph,jaspersr,etal.protectionofdogsfor13monthsagainstbordetellabronchisepticaandcanineparainfluenzaviruswithamodifiedlivevaccine.theveterinaryrecord,2005,157:19-23)、31123株(参见专利au516010)、kr001-a01株(保藏编号为fermp-21984，参见中国专利cn103153337a)；亚单位抗原如分离的犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白或其结构域的抗原，特别是重组的犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白，其被抗p68蛋白的特异性单克隆抗体bord2-7(描述于us7736658中，通过参考并入本文)识别，且在一个优选实施方式中，其具有如us7736658中所述的氨基酸序列或与其具有同源性；细菌提取物如brochicine^tmcae(pfizer)其从提取自支气管炎博德特氏菌细胞的抗原物制备，优选通过柱色谱法纯化的全细胞声处理物(wholecellsonicate)制备，见1984年10月12日提交的专利申请号fr2571618中所提供的；以及这些抗原形式组分的混合。

术语“p68蛋白”为犬支气管败血波氏杆菌中经sds聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的分子量为68kd的蛋白质，其被抗p68蛋白的特异性单克隆抗体bord2-7(atcc#)所识别，所述p68蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的登录号为he965806.1、hv491393.1、dl465896.1、di128761.1、dj055043.1、cq853559.1、cs417771.1、jq824384.1的p68蛋白基因序列。

术语“犬”通常被称为狗者，但也包括犬科家族的其他成员如狼、豺、貂、狐狸。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原含量为灭活的犬副流感病毒抗原10^2.0-10^8.0tcid50/头份或亚单位抗原9-260μg/头份；以及所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的支气管败血波氏菌抗原10^7.0-10^11.0cfu/头份或亚单位抗原8-300μg/头份。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒抗原含量为灭活的犬副流感病毒抗原10^5.0-10^7.0tcid50/头份或亚单位抗原12-100μg/头份；以及所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原10^8.0-10^10.0cfu/头份或亚单位抗原10-120μg/头份。

术语“tcid50”是指组织培养感染剂量，并且其被定义为感染50％的给定批次的已接种细胞培养所需的病毒稀释。各种方法可用于计算tcid50，包括sperman-karber方法，其用在通篇说明书中。关于spearman-karber方法的描述，参见bwmahy,hokangro.virologymethodsmanual,1996:25-46。在本发明中当抗原含量为灭活抗原含量时，表示灭活前的抗原含量。

术语“cfu”是菌落形成单位(colonyformingunits)的缩写，其表示：能产生微生物菌落的微生物、微生物芽孢/孢子(spore)、微生物的部分发育的芽孢或营养细胞的数目。在本发明中当抗原含量为灭活抗原含量时，表示灭活前的抗原含量。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述兽 医学上可接受的载体为佐剂；其中，所述佐剂包括明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙，非离子嵌段聚合物表明活性剂、病毒颗粒、皂苷、蛋白体、免疫刺激复合物、蜗形体、季胺、阿夫立定avridine、维生素a、维生素e，ribi佐剂系统、草分枝杆菌的细胞壁骨架、胞壁酰基二肽类mdp、三肽类mtp、单磷酰脂质a、卡介苗、热不稳定的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、cpg寡脱氧核苷酸，白介素il-1、il-2、il-6、il-12、il-15、il-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄甾酮、1,25-二羟基微生物d3，葡聚糖，聚甲基丙烯酸甲酯、卡波普carbopol，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，及水包油包水乳剂。

术语“兽医学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合用于与兽医对象组织接触但没有过分毒性、刺激、过敏反应等的物质，其与合理的收益/风险比相当并有效用于其预期用途。本发明中“兽医学上可接受的载体”是指不干扰有效成分的生物活性的效力并且对其所施用的兽医对象无毒的载体介质，包括任何溶剂、分散介质、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。其中，佐剂包括但不限于无机盐类如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙，表面活性剂和微粒如非离子嵌段聚合物表面活性剂(如胆固醇)、病毒颗粒、皂苷(如quila、qs-21、gpi-0100)、蛋白体、免疫刺激复合物、蜗形体(cochleate)、季胺(溴化二甲基双十八烷基铵dda)、阿夫立定avridine、维生素a、维生素e，细菌产物如ribi佐剂系统(ribiinc.)、草分枝杆菌(mycobacterumphlei)的细胞壁骨架()、胞壁酰基二肽类mdp、三肽类mtp、单磷酰脂质a、卡介苗(bacilluscalmete-guerin)、热不稳定的大肠杆菌肠毒素、霍乱毒素、海藻糖二霉菌酸酯、cpg寡脱氧核苷酸(oligodeoxnucleotide)，细胞因子及激素类如白介素(il-1、il-2、il-6、il-12、il-15、il-18)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、脱氢表雄甾酮、1,25-二羟基微生物d3，多聚阴离子类如葡聚糖，聚丙烯酸类如聚甲基丙烯酸甲酯、卡波普carbopol，水包油乳液如 (hydronics，美国)，油包水乳液如弗氏完全、不完全佐剂，及水包油包水乳剂；稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等；等渗剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖，及本领域技术人员已知的其他等渗剂；稳定剂包括白蛋白及本领域技术人员已知的其他稳定剂；防腐剂包括硫柳汞及本领域技术人员已知的其他防腐剂。优选地，所述兽医学上可接受的载体为佐剂；进一步优选地，所述佐剂包括氢氧化铝，以及皂苷与胆固醇的混合液。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物包括犬副流感病毒f、hn、np蛋白抗原中的任意两种蛋白抗原，每种蛋白抗原含量为6μg/头份；10μg/头份的犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白抗原以及10％v/v铝胶佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述f蛋白的基因序列包括在ncbi中公开的登录号为ay491509.1、ef546392.1、ef487542.1、ax586947.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1的f蛋白基因序列；

所述hn蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi中公开的登录号为ef543647.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、ef546393.1的hn蛋白基因序列；

所述np蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi中公开的登录号为ef543648.1、ef546391.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、ay581307.1的np蛋白基因序列。

作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述犬副流感病毒f、hn、np蛋白抗原序列为ncbi登录号为kc237063.1的f、hn、np蛋白序列；所述犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白抗原序列为ncbi登陆号为he965806.1的蛋白序列。

作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物包括4μg/头份的犬副流感病毒f、hn、np蛋白抗原；10μg/头份的犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白抗原以及10％v/v铝胶佐剂。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物还包括狂犬病病毒抗原、犬细小病毒抗原、犬瘟病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬钩端螺旋体抗原中的至少一种抗原。

在本发明的一个优选实施方式中，所述疫苗组合物还包括其他抗原，其他抗原可以是微生物的灭活完整或部分制剂，或是通过遗传过程技术或化学合成获得的抗原分子。按照本发明适合应用的其他抗原包括但不限于：病毒抗原如犬细小病毒(canineparvovirus)、犬瘟病毒(caninedistempervirus)、犬疱疹病毒(canineherpesvirus)、犬流感病毒(canineinfluenzavirus)、狂犬病病毒(rabiesvirus)，病原菌如布拉迪斯拉发钩端螺旋体(leptospirabratislava)、犬钩端螺旋体(leptospiracanicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(leptospiragrippotyphosa)、黄疸出血钩端螺旋体(leptospiraicterohaemorrhagiae)、波摩那钩端螺旋体(leptospirapomona)、哈德焦钩端螺旋体(leptospirahardjobovis)、卟啉单胞菌属(porphyromonasspp.)、类杆菌属(bacteriodesspp.)、疏螺旋体属(borreliaspp.)、链球菌属(streptococcusspp.，包括马链球菌亚种兽疫streptococcusequisubspecieszooepidemicus)、埃里希氏体属(ehrlichiaspp.)、支原菌属(mycoplasmaspp.，包括全支原体mycoplasmacynos)、小孢子菌(microsporumcanis)，致病真菌如念球菌属，原生动物如隐孢子虫、新孢子虫、弓形虫、艾美球虫属、巴贝虫属、贾第虫属、利什曼原虫属，或寄生虫如绦虫属、黄蝇属、棘球绦虫属、并殖吸虫属。

本发明所包括的病毒和细菌在用于疫苗组合物或免疫原性组合物中之前可以是减毒的活的、灭活的或亚单位的。减毒和灭活方法是本领域技术人员熟知的。减毒方法包括但不限于在细胞培养物中在核实的细胞系上连续传代(病毒和一些细菌)、在肉汤培养物中连续传代(细菌)、紫外线照射(病毒和细菌)和化学诱变(病毒和细菌)。病毒或细菌的灭活方法包括但不限于用福尔马林、β-丙内酯 (betapropriolactone,bpl)或二乙烯亚胺(binaryethylenimine,bei)处理或本领域技术人员已知的其他方法。

本发明所包括的细菌可利用本领域技术人员已知的各种培养基来培养和繁殖，包括肉汤培养基(液体)金额琼脂(固体、半固体)培养基。一些细菌还可在哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中培养并繁殖。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒含有犬副流感病毒抗原及犬支气管败血波氏杆菌抗原以及佐剂；其中，所述犬副流感病毒抗原为灭活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为减毒的活的支气管败血波氏杆菌抗原；或所述犬副流感病毒抗原为减毒的活的犬副流感病毒抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原或p68蛋白。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述犬副流感病毒抗原为灭活的犬副流感病毒抗原d008株抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为减毒的活的犬支气管败血波氏杆菌sd25d株抗原。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述犬副流感病毒抗原为f蛋白、hn蛋白、np蛋白中的至少一种，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为减毒的活的支气管败血波氏杆菌sd25d株抗原。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述犬副流感病毒抗原为减毒的活的犬副流感病毒cornell株抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为灭活的犬支气管败血波氏杆菌d-2株抗原。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述犬副流感病毒抗原为减毒的活的犬副流感病毒cornell株抗原，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原为p68蛋白。

本发明的另一方面涉及本发明试剂盒的使用方法，所述方法包括使用所述灭活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一种亚单位抗原复原所述减毒的活的犬支气管败血波氏杆菌抗原；或使用所述灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原或 p68蛋白复原所述减毒的活的犬副流感病毒抗原。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量为灭活的犬副流感病毒抗原10^2.0-10^8.0tcid50/头份或亚单位抗原9-260μg/头份，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原含量为减毒的活的犬支气管败血波氏杆菌抗原10^3.5-10^8.0cfu/头份。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量为所述减毒的活的犬副流感病毒抗原10^2.0-10^7.0tcid50/头份，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原含量为灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原10^7.0-10^11.0cfu/头份或p68蛋白亚单位抗原8-300μg/头份。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的试剂盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量为灭活的犬副流感病毒抗原10^5.0-10^7.0tcid50/头份或亚单位抗原12-100μg/头份；所述犬支气管败血波氏杆菌抗原含量为减毒的活的犬支气管败血波氏杆菌抗原10^4.0-10^7.0cfu/头份。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的试剂盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量为所述减毒的活的犬副流感病毒抗原10^2.5-10^4.5tcid50/头份，所述犬支气管败血波氏杆菌抗原含量为灭活的犬支气管败血波氏杆菌抗原10^8.0-10^10.0cfu/头份或亚单位抗原10-120μg/头份。

本发明的另一方面涉及一种制备本发明所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：(1)分别制备所述犬副流感病毒抗原、所述犬支气管败血波氏杆菌抗原；以及(2)按比例将所述步骤(1)中所述制备的犬副流感病毒抗原和支气管败血波氏菌抗原，混合，添加佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述犬副流感病毒亚单位抗原中f、hn、np蛋白中的至少两种可以串联表达。

本发明的另一方面涉及一种制备本发明所述的试剂盒的方法，其中，所述方法包括：(1)分别制备所述犬副流感病毒抗原、所述犬支气管败 血波氏杆菌抗原；(2)将所述步骤(1)中制备的灭活抗原或亚单位抗原添加佐剂，并与制备的活的减毒的抗原分别包装、放置。

作为本发明的一种实施方式，所述犬副流感病毒亚单位抗原中f、hn、np蛋白中的至少两种可以串联表达。

本发明的另一方面涉及本发明所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬传染性支气管炎的药物中的应用。

本发明的另一方面涉及本发明所述的试剂盒在制备预防和/或治疗犬传染性支气管炎的药物中的应用。

本发明的疫苗组合物可直接施用于肌内、鼻腔中或皮下，用于肠胃外施用的合适的方法包括肌内、滴鼻和皮下注射。作为本发明的一种优选实施方式，所述药物经肌肉注射给药。

术语“预防和/或治疗”在涉及犬窝咳时是指抑制犬副流感病毒、犬支气管败血波氏杆菌的复制、抑制犬副流感病毒、犬支气管败血波氏杆菌的传播或防止犬副流感病毒、犬支气管败血波氏杆菌在其宿主体内定居，以及减轻犬副流感病毒、犬支气管败血波氏杆菌感染的疾病或病症的症状。若病毒或细菌荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“犬窝咳”(kennelcough)又称犬传染性支气管炎(canineinfectioustracheobronchitis,itb)，是犬的一种急性高度接触性呼吸道传染病，具有高传染性、危害严重、影响范围广、易引发其他高致死性病原体感染等特点，主要引起幼犬突发性阵发性咳嗽并伴有不定量的鼻腔分泌物，常于春秋季节多发，由于犬群中一旦发病，很快引起正窝幼犬发病、咳嗽，故被称为“犬窝咳”。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中cpiv抗原中的活的抗原以cpivcornell株(源自)、灭活的抗原以cpivd008株(源自美国菌毒种中心，保藏号为vr-399)、亚单位的抗原以cpivf、hn和np蛋白(ncbi登录号均为kc237063.1)，及bb抗原中的活的抗原以bbsd25d株(保藏号为cgmccno.5292，参见中国专利cn102343088a)、灭活的抗原以bbd-2株(jacobsaac,theelenrph,jaspersr,etal.protectionofdogsfor13monthsagainstbordetellabronchisepticaandcanineparainfluenzaviruswithamodifiedlivevaccine.theveterinaryrecord,2005,157:19-23)、亚单位的抗原以bbp68蛋白(ncbi登录号为he965806.1)为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明实例中所用的样品保存液为pbs磷酸缓冲液，ph值为7.4，其1l体积配方为：nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、kh2po40.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1犬副流感病毒抗原的制备及含量测定

1.1cpiv活抗原的制备及含量测定

将cpivcornell株使用dmem培养液稀释后，按培养液体积5％v/v接种生长良好的vero细胞单层，37℃吸附30分钟，加入dmem培养液，置37℃、5％co2培养箱培养，待80％细胞出现病变时，置-20℃反复冻融2次，收获病毒液。将收获的cpivcornell株病毒液作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-64个稀释度，每个稀释度分别接种96孔细胞培养板5孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃、5％co2的温箱中培养7日，观察细胞病变(cpe)，根据reed-muench法计算 得出cpiv病毒含量为10^7.5tcid50/ml。

将收获的病毒液，按现行《中国兽药典》规定方法进行纯净性检验，检验结果：无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

将检验合格的cpicornell株病毒液，经3000转/分钟离心或中空纤维过滤柱过滤以除去细胞碎片，加入等体积10％脱脂奶粉作为冻干保护剂，混匀、冻干后分装，作为活的cpiv抗原，2-8℃保存备用。

1.2cpiv灭活抗原的制备、含量测定、灭活及其检验

将cpivd008株强毒株按照实施例1.1所述方法进行制备及含量测定，测定结果表明：cpiv病毒含量为10^7.5tcid50/ml。

将收获的cpivd008株病毒液按现行《中国兽药典》规定进行纯净性检验，检验结果表明：病毒液无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

将检验合格的cpivd008株病毒液，经3000转/分钟离心或经中空纤维过滤柱过滤以除去细胞碎片，然后于收获的cpiv病毒液中加入甲醛溶液使其终浓度为0.01％-0.1％v/v，置37℃灭活24-48小时，每4小时搅拌1次，每次10分钟，即为灭活的cpiv病毒液。取灭活的病毒液10倍稀释后接种已形成良好单层的vero细胞25cm²瓶内，每个灭活样品接种4瓶，每瓶接种1ml，27℃吸附1小时后弃去接种液，加入新鲜培养基，10ml/瓶，27℃培养72小时，同时设正常细胞对照。盲传1代，继续培养72小时，无细胞病变表明灭活检验合格。

1.3cpiv亚单位抗原的制备及含量测定

分别将cpivhn和f蛋白的序列(ncbi登录号均为kc237063.1)按照中国专利wo9929872a所述方法制备、纯化并浓缩cpivhn和f蛋白以用于制备亚单位抗原；将cpivnp蛋白的序列(ncbi登录号为kc237063.1)按照刘腾飞文献(刘腾飞.犬副流感病毒的检测和np基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫学活性的研究.新疆农业大学硕士学位论文,2010)里所提及的方法制备、纯化并浓缩cpivnp蛋白以用于制备亚单位抗原。将制得的hn、f和np蛋白分别采用bca定量试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)检测蛋白含量，hn、f和np蛋白浓度分别为1mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml。

实施例2犬支气管败血波氏杆菌抗原的制备及含量测定

2.1bb活抗原的制备及含量测定

将bbsd25d株冻干菌种用生理盐水复融后，划线接种于含5％新生牛血清的tsa平板，37℃培养24小时，观察菌落形态，挑取5-10个典型菌落，划线接种于含5％新生牛血清的tsa斜面，37℃培养24小时，作为一级种子，于2-8℃保存，使用期不超过2周。取一级种子按1％接种含5％新生牛血清的tsb液体培养基，37℃、200转/分钟，振荡培养16小时，取样进行纯粹检验，合格后作为二级种子，使用期不超过2周。取二级种子，按培养基量1％接种，37℃发酵培养24小时收获菌液，取样分别进行活菌计数和纯粹检验。培养收获的菌液纯粹检验合格，活菌计数结果为1×10¹²cfu/ml。将菌液离心，3000转/分钟离心10分钟，沉淀使用等体积含10％脱脂牛奶的耐热保护剂悬浮，并进行冻干，冻干后分装，2-8℃保存备用。

2.2bb灭活抗原的制备、含量测定、灭活及其检验

按实施例2.1方法，培养bbd-2株，经纯粹检验合格，活菌计数结果为1×10¹⁰cfu/ml。

将检验合格的bbd-2株菌液以3000转/分离心10分钟，取沉淀，根据活菌计数结果，将菌液使用生理盐水悬浮至活菌数为9×10¹⁰cfu/ml菌液，根据菌液体积，加入终浓度为0.3％甲醛溶液，37℃灭活16-24小时，期间每隔4小时搅拌或振荡一次。取灭活的菌液接种含5％新生牛血清的tsa平板，37℃培养48小时以进行灭活检验，检验合格。

2.3bb亚单位抗原的制备及含量测定

将bbp68蛋白的序列(ncbi登陆号为he965806.1)，按美国专利us7736658提供的方法制备、纯化并浓缩犬支气管败血波氏杆菌p68蛋白以制备亚单位抗原。将制备的p68蛋白液，采用bca蛋白定量试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)按照说明书进行蛋白含量测定，测得bbp68蛋白的含量为1mg/ml。

实施例3疫苗组合物的制备

用pbs溶液将实施例1、2制备的各抗原、铝胶佐剂(购自美国通用公司)按照表1所示组分进行配制。其中，灭活的或亚单位的抗原、活的抗原组成疫苗组合物(包括疫苗1、2、3、6)时，将灭活的或亚单位的抗原、铝胶佐剂用pbs溶液按表1中所示终浓度进行混合配制得混合液，并对各混合液分别进行性状检验(久置后上层为无色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液)、无菌检验(按现行《中国兽药典》进行检验，均无菌生长)；并对活抗原进行性状检验(为乳白色海绵状树洞团块，易于瓶壁脱离)、无菌检验(按现行《中国兽药典》进行检验，均无菌生长)。免疫使用时，使用含灭活的或亚单位的抗原、佐剂的混合液稀释活的抗原，使活的抗原的终浓度如表1所示。

表1疫苗组合物所含组分

实施例4疫苗组合物的动物实验

4.1疫苗组合物中的犬副流感病毒抗原的动物试验

先对含犬副流感病毒活抗原疫苗组合物的安全性进行研究，按表1中疫苗1和疫苗2中的犬支气管败血波氏杆菌抗原、铝胶佐剂所示含量分别制备两者的混合物，用于稀释犬副流感病毒活抗原cornell株，稀释后得疫苗1#、2#，其中每1ml均含犬副流感病毒10倍免疫剂量的抗原即10^4.0tcid50，用于疫苗1和疫苗2的安全性试验，肌肉注射5只14-21日龄易感(犬副流感病毒中和抗体效价低于1:2，抗原阴性和犬支气管败血波氏杆菌的抗原、抗体均为阴性)犬，间隔14日，以相同剂量和途径重复接种，观察21日，观察结果注射犬全部健活，无任何不良反应，表明疫苗1和疫苗2的安全性检验合格。

再进行免疫、攻毒试验，将实施例3制得的疫苗1-14经肌肉注射2-3月龄健康易感(犬副流感病毒中和抗体效价低于1:2，抗原阴性，犬支气管败血波氏杆菌抗原、抗体均为阴性)犬，1ml/只，于14日后，以相同途径和剂量加强免疫1次，同时设置5只免疫现有二联活疫苗(购自pfizeranimalhealth的cpi/b)作为现有技术对照、5 只未免疫犬作为空白对照。二免后观察14天，每天观察犬注射部位局部反应，同时观察犬精神、食欲及饮水状况。二免后28日，各试验组犬采血，elisa测定抗体效价，其中elisa抗体效价测定方法：将抗原分别使用碳酸盐缓冲液(ph值9.6)稀释为10μg/ml，包被96孔酶标反应板，100μl/孔，2～8℃包被过夜，使用pbst洗涤后，加入10％脱脂奶粉封闭，37℃封闭2h，弃去封闭液，洗涤后，2～8℃保存。将待检血清使用pbs系列稀释后，加入96孔板，37℃反应1小时，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗犬二抗，37℃作用1小时，洗涤，加入tmb底物显色15分钟，然后加入2m硫酸终止，测定od450nm值，以p/n≥2.1判为阳性，以判为阳性的最高稀释度作为待检血清的抗体效价，结果见表2。

二免后28日，各试验组犬均使用犬副流感病毒d008株病毒液(10^7.3tcid50/ml)经鼻腔途径进行攻毒，攻毒剂量为1ml/只，攻毒后每天测定犬直肠温度，并观察犬临床症状，包括咳嗽、流鼻涕，攻毒后观察14天，结果见表2。

表2疫苗免疫后抗犬副流感病毒elisa抗体及攻毒保护效果

注：发病标准：连续咳嗽2日或出现体温升高后不降(＞2日)或流鼻涕中一项临床症状判为发病；健康犬：未出现咳嗽和体温升高、流鼻涕症状，其中体温“未升高”表示为直肠温度不高于39.5℃；“升高”表示直肠温度高于39.5℃。

免疫后，观察犬精神、食欲、局部症状，并观察犬注射后行动状况；并结合表2，结果显示：(1)免疫疫苗1-14的犬均未出现由注射疫苗引起的腿部暂时性麻痹，观察14天，免疫犬精神、食欲正常，且局部未发现由注射疫苗引起的肿胀等副反应。(2)血清学检测表明，免疫疫苗1-14的各免疫犬注射疫苗后，均产生体液免疫，但不同组分疫苗elisa抗体效价不同，而含亚单位抗原的疫苗elisa抗体效价最高，并与现有技术对照组的相当甚至更高；特别地，elisa抗体效价随亚单位疫苗中抗原含量的升高而增大(见疫苗8-10)。(3)攻毒试验表明，除疫苗4、疫苗7攻毒后出现1/5体温升高后又降低，并出现咳嗽1天症状外，其余组在观察期均未出现体温升高、流鼻涕等症状，且无咳嗽犬，均未发病；而现有技术对照组的免疫犬攻毒后，5/5犬攻毒后第2天出现体温升高，2/5犬出现咳嗽症状且超过2日，3/5犬流鼻涕，其中3只犬发病；空白对照组犬中4/5犬攻毒后第2天出现体温升高，5/5犬出现咳嗽症状且超过2日，5/5犬流鼻涕，5只对照犬均发病。总之，疫苗1-14的免疫效果相当甚至优于现有技术对照组的。

4.2疫苗组合物中的犬支气管败血波氏杆菌抗原的动物试验

先含犬支气管败血波氏杆菌活抗原疫苗组合物的安全性试验进行研究，按表1中疫苗3和疫苗6中的犬副流感病毒抗原、铝胶佐剂所示含量分别制备两者的混合物，用于稀释犬支气管败血波氏杆菌活抗原sd25d株，稀释后得疫苗3#、6#，且每1ml均含犬支气管败血波氏杆菌10^9.0cfu，用于疫苗3和疫苗6的安全性试验。将疫苗3#、6#分别肌肉注射5只14～21日龄易感(血清凝集效价低于1:16、气管分泌物bb分离培养阴性、犬副流感病毒抗原与抗体均为阴性)犬，间隔14日，以相同剂量和途径重复接种，观察21日，观察结果显示：注射犬全部均健活，无任何副反应，表明疫苗3和疫苗6安全性试验合格。

再进行免疫、攻毒试验，将实施例3制得的疫苗1～14分别肌肉接种56日龄健康易感(血清凝集效价低于1:16、气管分泌物bb分离培养阴性抗体阴性)犬5只，1ml/只，于14日后，以相同途径和剂量加强免疫1次，同时设置5只免疫现有二联活疫苗(购自pfizeranimalhealth的cpi/b)作为现有技术对照、5只未免疫犬作为空白对照。免后观察14天，每天观察犬注射部位局部反应，同时观察犬精神、食欲及饮水状况。并于二免后28天采集免疫组及对照组犬血清，并进行elisa抗体效价测定，其中elisa抗体效价测定方法：将p68抗原分别使用碳酸盐缓冲额(ph值9.6)稀释为5μg/ml，包被96孔酶标反应板，100μl/孔，2～8℃包被过夜，使用pbst洗涤后，加入10％脱脂奶粉封闭，37℃封闭2h，弃去封闭液，洗涤后，2～8℃保存。将待检血清使用pbs系列稀释后，加入96孔板，37℃反应1小时，加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗犬二抗，37℃作用1小时，洗涤，加入tmb底物显色15分钟，然后加入2m硫酸终止，测定od450nm值，以p/n≥2.1判为阳性，以判为阳性的最高稀释度作为待检血清的抗体效价，结果见表3。

二免后28日使用犬支气管败血波氏杆菌强毒株bc株1.3×10¹⁰cfu/ml通过气溶胶进行攻毒。攻毒后，每天早晚观察犬的临床症状2次，观察14天，连续2天观察到咳嗽判为发病，同时，攻毒后每天测定犬直肠温度，观察结果见表3。

表3疫苗免疫后抗犬支气管败血波氏杆菌抗体效价及攻毒保护效果

*注：发病：连续咳嗽2日或出现体温升高后(＞2日)判为发病；健康犬：未出现咳嗽和体温升高症状。体温“未升高”表示为直肠温度不高于39.5℃；“升高”表示直肠温度高于39.5℃。

结合免疫后的观察情况及表3可知：(1)免疫疫苗1-14的犬均未出现由注射疫苗引起的腿部暂时性麻痹，观察14天，免疫犬精神、食欲正常，且局部未发现由注射疫苗引起的肿胀等副反应。(2)二免后28日，免疫疫苗1-14的犬均产生elisa抗体效价，与现有技术对照组的相当甚至高于现有技术对照，表明疫苗1-14均具有较好的免疫原性，特别地，含亚单位抗原的疫苗免疫效果最好。(3)攻毒试验结果显示免疫 疫苗1、4、8犬，均有1/5犬出现轻微咳嗽且体温升高后又降低，其余疫苗未出现咳嗽或体温升高，均获得保护。而现有技术对照组即免疫cpi/b疫苗的犬2只连续3-5天出现严重的咳嗽、体温升高症状，空白对照组自攻毒后第5天开始至14天所有犬5/5均连续咳嗽超过8天、体温升高均发病。总之，疫苗1-14相对于现有疫苗的免疫效果相当甚至更好。

综上所述：(1)所述疫苗组合物的免疫后不仅没有麻痹、肿胀副反应发生且未发生咳嗽、体温升高的临床症状，而且免疫效果与现有商品化疫苗的相当甚至更高，特别地，含亚单位抗原的疫苗效果最好；(2)所述疫苗组合物免疫时操作简便，克服了现有商品化疫苗接种期间接种给动物时发生打喷嚏从而暴露给兽医工作者或接触者。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。