抑制肿瘤细胞组合物的制作方法

本发明是关于一种从植物原料所得的植物萃取物，依一定比例调配的组合物，该组合物具有抑制肿瘤细胞生长的功能。

背景技术：

近10年恶性肿瘤皆位于10大死因之首，其中肺癌、肝癌以及大肠癌之死亡率不论男女皆为前3名，对女性而言死亡率排第4、5名分别为乳癌及胰脏癌，而男性则是口腔癌以及食道癌，不论国内外医生以及研究学者皆致力于研究如何避免或降低肿瘤细胞的产生或增生。

肺纤维化是指肺部组织受到炎症的影响，令肺泡被纤维物质取代，使原本柔软的肺部组织变坚硬，失去弹性，逐渐丧失收缩、舒张及气体交换的能力，令患者有气促、胸口闷痛或干咳等现象，严重时会无法呼吸，最终导致呼吸衰竭。

上述的疾病现今都有药物或方式进行治疗或抑制，然，该等药物多为化学合成或利用放射疗法，如此在治疗过程中许多患者会有副作用产生，往往副作用所产生的症状比疾病本身更令患者不适，此为一大缺点。

桧木(Chamaecyparisformosensis)，为松柏类柏科中常绿乔木的一种，在针叶数中占非常重要的地位，因桧木幽香无辛味，木质坚硬，不易腐朽或虫蛀等特性，进一步研究出桧木含有优越的抑制伤寒菌、大肠杆菌、白癣菌及金黄色葡萄球菌等，具有消炎作用。

牛樟树(Cinnamomumkanehirai)，属于樟科植物，树姿挺拔劲秀，为景观树木绝佳树种，其木材性质优异，具有独特香味，亦是木刻艺品及家具的上好材料；牛樟树常长有牛樟芝，牛樟芝含有三帖类化合物、超氧歧化酵素、腺甘、多醣体、多种蛋白质、多种维生素等，具有抗肿瘤、增加免疫力、降血糖以及降胆固醇等功能，目前有关牛樟芝的相关研究多集中在牛樟芝，尚无研究显示牛樟木本身或其萃取物具有明确抗肿瘤的作用。

台湾肖楠(Calocedrusformosana)，为柏科肖楠属的常绿大乔木之台湾特有种，具特殊香气，质地致密，纹路优美，研究显示其萃取物具有抗真菌、抗氧化以及抗发炎等活性，惟有关肖楠成分的研究多以枝叶萃取物为主，对于木头心材萃取物的研究较少，尚无相关研究显示肖楠木的萃取物具有明确抑制癌症细胞的效果。

近年来的研究发现，大自然中有许多植物(如上所述)具有抗发炎或抗氧化等功能，尤其是植物的蒸馏萃取物具有改善细胞膜通透性的功能，可让细胞所需的养分以及氧气得以顺利进入细胞内，并将细胞所产生的废物排出细胞外，提升细胞新陈代谢的能力，如此细胞因而获得健康活化，令所有组织、器官以及免疫系统的功能恢复正常，提供人体本身的免疫力、抵抗力以及自体修复能力。

专利号I407995揭露一种植物萃取液体的制备方法及其组合物溶液，其中包括将植物原料刨木切成片状体，放入一灶窑蒸馏的主炉，且放入木材点火燃烧，并设定分馏温度，当达到各种植物原料蒸气反应时间后，再经冷却与分离即可产出各种植物的蒸馏萃取物；使用专利号I407995方法制得的萃取物无论是精油层或水层(纯露)，与一般机器蒸馏法所制得的精油与纯露有所不同，其特征在于使用该发明方法制得的萃取物(精油或纯露)均含有比一般机器蒸馏法所得之萃取物(精油或纯露)更丰富的化合物。

又，该些植物虽各别具有抗氧化、抗发炎等功能，但目前研究对该些植物单方可治疗那些疾病仍为未知，且单方植物的萃取物在抑制肿瘤上效果不佳，无法广泛应用，此为二大缺点。

申请人鉴于习知抑制技术的缺失，乃发明一种利用复合天然材料，可抑制、降低或减缓疾病之症状，用以改善上述现有技术的缺失。

技术实现要素：

本发明的主要目的，在于提供一种天然植物萃取物组合物(TGLON组合物)，该组成物具有调整或增加细胞新陈代谢的功能，并具有抑制肿瘤细胞生 长的功能。

为达上述的目的，本发明的特征在于：利用台湾低中高海拔不同生长植物的原理，设计出The Greatest Love of Nature复方植物萃取物组合物(TGLON组合物)，利用下述植物萃取物依特定比例组合成一抑制肿瘤细胞组合物；其成份包含有：桧木、牛樟、肖楠、香樟、香茅、山胡椒、肉桂、冷香杉、茶树、尤加利树、柳杉以及相思树萃取物。

本发明的另一特征在于，前揭植物萃取物是使用专利号I407995方法制得的纯露；使用专利号I407995方法制得的纯露其特征在于：相较于一般纯露，其中含有更丰富的化合物组成。

将TGLON组合物经序列稀释后，分别与乳癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(HepG2)以及肺纤维细胞(MRC-5)培养72小时，接着利用ELISA Reader(540nm)分析该等细胞株的存活率，经结果显示，将该组合物稀释到约40倍时即具有50％以上的抑制细胞生长效果。

附图说明

图1为本发明对乳癌细胞株相对存活率试验百分比关系图。

图2为本发明对抑制乳癌细胞株试验抑制百分比线性回归曲线图。

图3为本发明对肺纤维细胞株相对存活率试验百分比关系图。

图4为本发明对抑制肺纤维细胞株试验抑制百分比线性回归曲线图。

图5为本发明对肝癌细胞株相对存活率试验百分比关系图。

图6为本发明对抑制肝癌细胞株试验抑制百分比线性回归曲线图。

图7为本发明组合物的成分分析图。

图8为本发明成分的桧木纯露成分分析图。

图9为本发明成分的牛樟纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图10为本发明成分的肖楠纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图11为本发明成分的香樟纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图12为本发明成分的香茅纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图13为本发明成分的山胡椒纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图14为本发明成分的肉桂纯露成分分析图。

图15为本发明成分的冷香杉纯露成分分析图。

图16为本发明成分的茶树纯露成分分析图。

图17为本发明成分的尤加利树纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图18为本发明成分的柳杉纯露成分分析图，小于0.05％成分未标示。

图19为本发明成分的相思树纯露成分分析图。

具体实施方式

为便于贵审查委员对本案的抑制肿瘤细胞组合物有更进一步的认识与了解，兹举实施例配合图式，详细说明如下。

本发明的一抑制肿瘤细胞组合物(TGLON组合物)，该抑制肿瘤细胞组合物包含下列群体之植物萃取物：桧木、牛樟、肖楠、香樟、香茅、山胡椒、肉桂、冷香杉、茶树、尤加利树、柳杉以及相思树；将该等植物原料利用分离技术萃取植物的有效成分，其中分离技术可为：蒸馏法、溶剂萃取法、冷压榨法、二氧化碳超临界萃取法以及吸收法等；TGLON组合物本身具有调整或增加细胞新陈代谢之功能，并具有抑制肿瘤细胞生长的功能。

进一步说明，本发明的植物萃取物是使用蒸馏法所制得的纯露，更进一步说明，为专利号I407995方法所制得的纯露，使用专利号I407995方法制得的纯露其特征在于：相较于一般纯露，其中含有更丰富的化合物组成。

本发明另利用台湾低中高海拔不同生长植物混合始具备完整疗效的原理，进一步将上述植物的纯露混合即为该抑制肿瘤细胞组合物，混合的重量百分比为：桧木纯露占40％～50％、牛樟纯露占10％～20％、肖楠纯露占10％～20％、香樟纯露占8％～10％、香茅纯露占8％～10％、山胡椒纯露占6％～8％、肉桂纯露占6％～8％、冷香杉纯露占4％～6％、茶树纯露占2％～4％、尤加利树纯露占2％～4％、柳杉纯露占2％～4％以及相思树纯露占2％～4％。

进一步利用该抑制肿瘤细胞组合物对乳癌细胞(MCF-7)、肺纤维细胞(MIRC-5)以及肝癌细胞(HepG2)进行肿瘤细胞存活率实验。

实施例1

于本实施例中，先将该抑制肿瘤细胞组合物以不同倍数稀释，接着加入至乳癌细胞株(MCF-7)中培养，再利用MTT比色法，进行该组合物对乳癌细胞株生长抑制试验，观察该组合物是否对乳癌细胞株生长有抑制的效果，其抑制浓度为何。

首先，将生长状况良好的乳癌细胞株接种至96微孔平盘，每孔细胞数约3,000cells，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养至隔夜，隔天加入该抑制肿瘤细胞组合物，在加入该组合物前先以0.22μm滤膜过滤除菌，再以无菌水进行2倍序列稀释，取稀释后的该组合物剧烈震荡后加入含细胞的96微孔中，最终浓度分别为：40960X、20480X、10240X、5120X、2560X、1280X、640X、320X、160X、80X、40X、20X、以及10X，于5％CO₂、37℃培养箱中培养72小时，72小时后加入1/10总体积的MTT(5mg/mL)溶液到每个微孔中，于5％CO₂、37℃培养箱中培养4小时，接着移除微孔中的混合液体，加入100μl DMSO于每微孔中，以溶出细胞内蓝紫色结晶物(formazan)，进一步将96微孔平盘置于ELISA reader(540nm)读取数据并分析。

请参阅表1以及图1、2所示，该组合物对乳癌细胞生长有明显抑制存活的效果，在稀释倍数为80倍时，其抑制效果可达50％，于稀释倍数10倍至40倍时，该组合物对于乳癌细胞生长的抑制效果可高达98％以上。

请再参阅图2所示，根据该组合物浓度(Y轴)，与其相对应的抑制百分比(X轴)的数据以二维线性回归分析后可得一回归公式：Y＝160.02-1.8222X+0.0043X²，将X＝50带入回归公式计算得Y＝80，该值即为该组合物对于乳癌细胞株的半抑制浓度(50％Inhibition Concentration,IC₅₀)约为80倍稀释浓度。

表1.本发明的组合物对乳癌细胞株(MCF-7)生长抑制试验

实施例2

于本实施例中，先将该抑制肿瘤细胞组合物以不同倍数稀释，接着加入至肺纤维细胞株(MRC-5)中培养，再利用MTT比色法，进行该组合物对肺纤维细胞株生长抑制试验，观察该组合物是否对肺纤维细胞有抑制生长的效果，其抑制浓度为何。

首先，将生长状况良好的肺纤维细胞株接种至96微孔平盘，每孔细胞数约3,000cells，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养至隔夜，隔天加入该抑制肿 瘤细胞组合物，在加入该组合物前先以0.22μm滤膜过滤除菌，再以无菌水进行2倍序列稀释，取稀释后的该组合物剧烈震荡后加入含细胞的96微孔中，最终浓度分别为：40960X、20480X、10240X、5120X、2560X、1280X、640X、320X、160X、80X、40X、20X、以及10X，于5％CO₂、37℃培养箱中培养72小时，72小时后加入1/10总体积的MTT(5mg/mL)溶液到每个微孔中，于5％CO₂、37℃培养箱中培养4小时，接着移除微孔中的混合液体，加入100μlDMSO于每微孔中，以溶出细胞内蓝紫色结晶物(formazan)，进一步将96微孔平盘置于ELISA reader(540nm)读取数据并分析。

请参阅表2以及图3、4所示，该组合物对肺纤维细胞株有明显抑制存活的效果，在稀释倍数为40倍时，其抑制效果可达50％以上，于稀释倍数10倍至20倍时，该组合物对于肺纤维细胞生长的抑制效果可高达97％以上。

请再参阅图4所示，根据该组合物浓度(Y轴)，与其相对应的抑制百分比(X轴)的数据以二维线性回归分析后可得一回归公式：Y＝83.595-0.787X+0.0008X²，将X＝50带入回归公式计算得Y＝46，该值即为该组合物对于肺纤维细胞株(MRC-5)的半抑制浓度(50％Inhibition Concentration,IC₅₀)约为46倍稀释浓度。

表2.本发明的组合物对肺纤维细胞株(MRC-5)生长抑制试验

实施例3

于本实施例中，先将该抑制肿瘤细胞组合物以不同倍数稀释，接着加入至肝癌细胞株(HepG2)中培养，再利用MTT比色法，进行该组合物对肝癌细胞株生长抑制试验，观察该组合物是否对肝癌细胞株有抑制生长的效果，其抑制浓度为何。

首先，将生长状况良好的肝癌细胞株接种至96微孔平盘，每孔细胞数约3,000cells，置于5％CO₂、37℃培养箱中培养至隔夜，隔天加入该抑制肿瘤细胞组合物，在加入该组合物前先以0.22μm滤膜过滤除菌，再以无菌水进行2倍序列稀释，取稀释后的该组合物剧烈震荡后加入含细胞的96微孔中，最终浓度分别为：40960X、20480X、10240X、5120X、2560X、1280X、640X、320X、160X、80X、40X、20X、以及10X，于5％CO₂、37℃培养箱中培养72小时，72小时后加入1/10总体积的MTT(5mg/mL)溶液到每个微孔中，于5％CO₂、37℃培养箱中培养4小时，接着移除微孔中的混合液体，加入100μl DMSO于每微孔中，以溶出细胞内蓝紫色结晶物(formazan)，进一步将96微孔平盘置于ELISA reader(540nm)读取数据并分析。

请参阅表3以及图5、6所示，该组合物对肝癌细胞株有明显抑制存活的效果，在稀释倍数为160倍时，其抑制效果可达50％以上，于稀释倍数10倍至40倍时，该组合物对于肝癌细胞生长的抑制效果可高达97％以上。

请再参阅图6所示，根据该组合物浓度(Y轴)，与其相对应的抑制百分比(X轴)的数据以二维线性回归分析后可得一回归公式：Y＝0.0367X²-10.128X+66.72，将X＝50带入回归公式计算得Y＝253，该值即为该组合物对于肝癌细胞株(HepG2)的半抑制浓度(50％Inhibition Concentration,IC₅₀)约为253倍稀释浓度。

表3.本发明的组合物对肝癌细胞株(HepG2)生长抑制试验

实施例4

请参阅图7，由上述实施例中可确认该组合物具有抑制肿瘤细胞生长的功能，接着发明人将该抑制肿瘤细胞组合物进行GC/MS分析，其中所含的化学成分包括：1,8-桉叶醇(1,8-Cineole)、樟脑(Camphor)、龙脑(Borneol)、4-萜烯醇(Terpinen-4-ol)、α-松油醇(α-Terpineol)、(-)-桃金娘烯醇((-)-Myrtenol)、cis-桃金娘烷醇(cis-Myrtanol)、α-蒎烯(α-Pinene)、莰烯(Camphene)、桧烯(Sabinene)、月桂烯(Myrcene)、1,4-桉叶醇(1,4-Cineole)、α-松油烯(α-Terpinene)、伞花烃(Cymene)、柠檬烯(Limonene)、γ-松油烯(γ-Terpinene)、α-萜品油烯(α-Terpinolen)、小茴香醇(α-Fenchol)、香茅醛(Citronellal)、香茅醇(Citronellol)、:橙花醇(Nerol)、黄樟醚(Safrole)、α-乙酸松油酯(α-Terpinylacetate)、β-榄香烯(β-Elemene)、α-雪松烯(α-Cedrene)、β-雪松烯(β-Cedrene)、α-紫穗槐烯(α-Amorphene)、β-芹子烯(β-Selinene)、γ-2-杜松烯(γ-2-Cadinene)、α-依兰油烯(α-Muurolene)、γ-杜松烯(γ-Cadinene)、δ-杜松烯(δ-Cadinene)、β-杜松烯(β-Cadinene)、榄香醇(α-Elemol)、雪松醇(Cedrol)、α-荜澄茄油烯(α-Cubebene)、γ-桉油醇(γ-Eudesmol)、β-桉油醇(β-Eudesmol)、tau-依兰油醇(tau-Muurolol)。

请参阅图8-19，发明人进一步利用GC/MS分别分析该抑制肿瘤细胞组合物中各个植物纯露的成分，小于0.05％成分未标示于图式上。

上列详细说明系针对本发明之可行实施例的具体说明，但是该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。