本发明涉及一种橘皮总黄酮的提取方法。
背景技术：
橘皮，又称为橘皮，为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮。橘皮中的黄酮类化合物主要有黄酮、黄酮醇、黄酮烷酮、元花色素等，多以糖苷或苷元的形式存在，包括橘皮苷，新橘皮苷，川橘皮素，柑橘素，二氢川橘皮素，橘皮素等，以上黄酮成分在抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、防治心血管疾病、镇静消炎、抗菌杀虫、抗血小板凝集等方面均有显著的生物活性，在医学、食品和保健品领域中的应用前景广泛。
目前针对于橘皮总黄酮的常用提取方法如下：CN104306501A公开的柑橘皮总黄酮的微波辅助提取方法，利用乙醇作为溶剂在微波条件下进行处理；《纤维素酶提取橘皮黄酮的工艺条件》中公开的在酸性条件下利于纤维素酶对纤维素水解，然后加入甲醇进行提取（食品与生物技术学报，27卷2期）；CN102000183A公开了一种利用利用工业酒精回流的提取。
由于黄酮类结构中存在酚羟基，稳定性差，所以在用以上方法进行直接提取的时候很容易发生氧化，提取效果并不理想。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种总黄酮得率高，稳定性好的橘皮总黄酮的提取方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
(1)将橘皮进行粉碎，过80目筛，加入相当于橘皮重量3~5倍的水，用5wt%NaOH调pH值至8.5~9.5，搅拌10~20min，向其中依次加入碱性纤维素酶、碱性果胶酶、三乙醇胺、氟化钠、D-异抗坏血酸钠和氧化铝颗粒，并在负压条件下，保持温度在40-65℃之间搅拌0.5-6h，其中橘皮与碱性纤维素酶、碱性果胶酶、三乙醇胺、氟化钠、D-异抗坏血酸钠和氧化铝颗粒的质量比为：100:0.30~0.60:0.20~0.45:3~7:3~5:2~4:100~150，所述氧化铝颗粒的粒径为150-250μm；
(2)用碱溶液调节步骤(1)所得溶液的pH至11~13，过滤，取滤液，加入相当于橘皮质量3-5%的亚硝酸钠，用酸调pH至4~5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
作为本发明进一步的改进， 所述步骤(2)中的酸为0.1mol/L的HCl。
作为本发明进一步的改进，所述步骤(2)中的碱溶液为10wt%NaOH溶液。
作为本发明进一步的改进，所述橘皮与碱性纤维素酶、碱性果胶酶、三乙醇胺、氟化钠、氯化钙和氧化铝颗粒的质量比为：100:0.45:0.3:5:4:3:120。
作为本发明进一步的改进，所述的负压范围为-0.07~-0.12MPa。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
本发明所提供的方法适用于从橘皮中提取总黄酮，碱性条件下利用碱性纤维素酶和碱性果胶酶的双重作用对橘皮中的果胶和纤维素进行水解，以利于总黄酮和挥发油的溶出，三乙醇胺、氟化钠和D-异抗坏血酸钠的有效提高了总黄酮的提取率，提取过程中的负压条件以及固体氧化铝颗粒的协同作用，减少了提取溶液的乳化作用，为总黄酮的提取创造了有利的条件。本发明所提供的方法，用碱溶酸沉的原理，提高了橘皮总黄酮的得率，并有效提高了总黄酮的稳定性。
附图说明
附图1为芦丁标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
实施例1
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺、4g氟化钠、3gD-异抗坏血酸钠和120g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮13.78g，总黄酮含量为95.37%，经检测主要含有橙皮苷、川陈皮素和橘皮素。
实施例2
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.6g碱性纤维素酶、0.2g碱性果胶酶、3g三乙醇胺、5g氟化钠、2gD-异抗坏血酸钠和100g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮13.06g，总黄酮含量为95.12%，经检测主要含有橙皮苷、川陈皮素和橘皮素。
实施例3
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.3g碱性纤维素酶、045g碱性果胶酶、3g三乙醇胺、3g氟化钠、4gD-异抗坏血酸钠和150g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮13.27g，总黄酮含量为95.33%，经检测主要含有橙皮苷、川陈皮素和橘皮素。
实施例4
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入500ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9.5，搅拌20min，向其中依次加入0.3g碱性纤维素酶、045g碱性果胶酶、3g三乙醇胺、3g氟化钠、4gD-异抗坏血酸钠和150g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.12MPa，保持温度在40℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至13，过滤，取滤液，加入3g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4，析出沉淀，过滤得到总黄酮13.11g，总黄酮含量为95.08%，经检测主要含有橙皮苷、川陈皮素和橘皮素。
实施例5
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入400ml的水，用5wt%NaOH调pH值至8.5，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺、4g氟化钠、3gD-异抗坏血酸钠和120g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在65℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12，过滤，取滤液，加入5g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至5，析出沉淀，过滤得到总黄酮13.23g，总黄酮含量为95.48%，经检测主要含有橙皮苷、川陈皮素和橘皮素。
对比例1
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶和0.3g碱性果胶酶，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例2
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶和120g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例3
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶和5g三乙醇胺，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例4
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶和4g氟化钠，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h， 然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例5
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶和3gD-异抗坏血酸钠，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例6
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、4g氟化钠和3gD-异抗坏血酸钠，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例7
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺和4g氟化钠，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例8
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺和3gD-异抗坏血酸钠，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例9
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺、4g氟化钠和3gD-异抗坏血酸钠，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例10
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺和150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例11
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺、4g氟化钠、3gD-异抗坏血酸钠和120g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮
对比例12
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，加入0.5g纤维素酶和0.3g果胶酶，加入pH为4.8的HAc-NaAc缓冲液，50℃水浴1.5h，用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例13
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，加入0.5g纤维素酶、0.3g果胶酶、5g三乙醇胺、4g氟化钠、3gD-异抗坏血酸钠和120g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，加入pH为4.8的HAc-NaAc缓冲液，抽真空至-0.08MPa，50℃水浴1.5h，用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，加入4g亚硝酸钠，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮。
对比例14
按照中国药典中的提取方法：取橘皮粗粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（60-90℃）80ml，加热回流2-3小时，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80ml，再加热回流至提取液无色，放冷，滤过，减压蒸馏得到总黄酮。
对比例15
一种橘皮总黄酮的提取方法，其具备包括如下步骤：
将100g橘皮进行粉碎，过80目筛，加入300ml的水，用5wt%NaOH调pH值至9，搅拌15min，向其中依次加入0.45g碱性纤维素酶、0.3g碱性果胶酶、5g三乙醇胺、4g氟化钠、3gD-异抗坏血酸钠和120g粒径为150-250μm的氧化铝颗粒，抽真空至-0.08MPa，保持温度在55℃之间搅拌2h，然后降至室温。
用10wt%NaOH溶液调节上述所得溶液的pH至12.5，过滤，取滤液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，析出沉淀，过滤得到总黄酮13.78g。
效果例1
1 破壁率检测：用低倍显微镜进行观测，以每个视野为单位，读取100个视野取平均值后按下式进行计算：
破壁率(％)＝(1-A/B)×100％
式中：A为破碎后的完整细胞数；
B为原始细胞数。
2 总黄酮含量的检测，对实施例1、对比例1-5得到的总黄酮进行含量检测，具体方法如下：
2.1 标准曲线的制备
精确称取芦丁标品20mg，用100mL容量瓶经60%乙醇溶解并定容，得到0. 2 mg/ml的芦丁标准液，4℃保存备用。分别精密量取芦丁标准液。0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml于25 ml容量瓶，各加60%乙醇至6 ml，随后加入1 ml的5 % NaNO2，静置6 min后加入10% Al(NO3)3溶液1 ml，摇匀，放置6 min，添加4%的NaOH溶液10 ml，用水加至刻度线，混匀放置15 min后于510 nm比色。用浓度(mg/ml)为横坐标(C)，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线见图1，方程为，相关系数r = 0.9997，表明吸光度在0.2-0.8mg/ml范围内芦丁浓度与吸光度有良好的线性关系。
2.2总黄酮含量的测定
量取总黄酮0.25g置于50ml的容量瓶中用60%乙醇定容，得到样品溶液，量取样品溶液 1 ml于 10 ml 试管，加0.5 mol/L NaNO2溶液0.50 ml摇匀，静置6 min后加入0.3 mol/L AlCl3溶液0.50 mL摇匀，放置6 min；然后再加入1.0 mol/L NaOH溶液4.00 ml，用60%乙醇定容，静置15min后，于505 nm处测吸光度。利用标准回归方程计算样品溶液中总黄酮的浓度，再进一步计算其含量和得率，具体计算方法如下：
。
3总黄酮得率的测定：
对实施例1、对比例1-12步骤(1)得到的溶液按上述方法1检测破壁率，对实施例1、对比例1-12得到的总黄酮按上述方法2和3分别进行含量检测和提取率测定，结果见表1：
表1
由上表所示，在不加入任何辅助剂的条件下，碱性纤维素酶和碱性果胶的破壁效果并不理想，单纯的加入三乙醇胺、氟化钠和D-异抗坏血酸钠，破壁效果和溶出效果虽然有小幅度提升，氧化铝颗粒可以有效提高细胞破壁率和总黄酮的溶出，负压的提取环境可以降低提取液的乳化，在氧化铝颗粒的协同作用下，利于挥发油类油脂的祛除，提高了总黄酮的提取率。在酸沉步骤中，向溶液中加入亚硝酸钠，可以有效提高总黄酮的稳定性，避免结构中酚羟基的氧化，本发明的方法较传统工艺提取方法提出率提高了近2倍，提取效果理想。
本发明中的碱性纤维素酶可为短小芽孢杆菌AC-4所产的酶，也可为现有技术中其他已经分离获得的碱性纤维素酶。碱性果胶酶可选用现有技术中的分离获得的碱性果胶酶。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。