知母皂苷AⅢ纳米脂质体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药和中药学的制剂领域，尤其是涉及中药有效成分知母皂苷AⅢ的纳米脂质体及其制备方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用。

背景技术：

癌症(Cancer)，亦称恶性肿瘤(Malignant neoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。肿瘤作为一类严重威胁人类生命的重大疾病，由于其治愈率低，复发率高，已成为人类疾病死亡的主要因素。据报道，在2012年全球范围内，共造成820万人死亡，其中以肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌为主。目前癌症的主要治疗方法有外科手术、放射治疗和化疗等，以治疗疾病或延长生命并改善患者生活质量。然而这些方法常常给患者带来巨大的痛苦，且治疗过程中产生较大的耐药性和较高的复发率。中药和天然药物对治疗癌症具有一定的疗效，已逐渐被国内外医学界广泛接受。那么，能否利用现代中药研究技术，发现一种对肿瘤细胞杀伤力强，毒副作用小的药物和治疗方法，对肿瘤的临床治疗具有深远意义。

知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)的干燥根茎，味苦，性寒，归肺、胃、肾经。具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等功效。知母的化学成分主要有甾体皂苷、双苯吡酮类、黄酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类及微量元素等，其中皂苷类是其主要的成分之一，约占知母根茎的6％。知母皂苷为知母的主要药理活性成分，知母皂苷AⅢ在知母药材中含量很低，而知母中含量较高的知母皂苷BII可通过酶解转化为知母皂苷AⅢ。现代药理学研究表明知母皂苷AⅢ对肺癌、肝癌、肠癌、结肠癌、胰腺癌的肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制作用。

虽然根据体外细胞试验的结果，知母皂苷AⅢ能够抑制肿瘤细胞增殖；然而，在实际应用中，因知母皂苷AⅢ的水溶性较差，体内生物利用度较低，严重影响知母皂苷AⅢ的药效发挥。本发明通过知母皂苷AⅢ纳米脂质体的制备，不仅改善了知母皂苷AⅢ的水溶性，而且提高了其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。知母皂苷AⅢ脂质体包封率较高，稳定性较好，整体动物实验也表明知母皂苷AⅢ脂质体对肿瘤生长具有较好的抑制作用，优于知母皂苷AⅢ，可用于恶性肿瘤的预防与治疗。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

本发明另一个目的是提供这种知母皂苷AⅢ纳米脂质体的制备方法。

本发明还提供了这种知母皂苷AⅢ纳米脂质体在制备抗肿瘤药物方面的应用。

本发明所采用的知母皂苷AⅢ，来源于传统中药知母中主要皂苷知母皂苷BII的酶解产物，其分子式为C₃₉H₆₄O₁₃，分子量740.917660，结构式如式I所示。

本发明的技术方案为，一种知母皂苷AⅢ纳米脂质体，由知母皂苷AⅢ和磷脂等组成，其制备处方中，知母皂苷AⅢ、磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(或二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇)的摩尔比为1：8～10：0～2。用该方法所制备的知母皂苷AⅢ脂质体的载药量高于5％，包封率高于75％。该处方下知母皂苷AIII纳米脂质体的稳定性高，不易泄露。

制备知母皂苷AⅢ纳米脂质体的方法，包括以下步骤：

将知母皂苷、磷脂等膜材溶于有机溶剂中，除去所述的有机溶剂形成脂膜，再加入缓冲液进行水合，得到知母皂苷AⅢ脂质体的粗悬液，将所得到的粗悬液进行超声或经高压均质仪处理后，得到所述知母皂苷AⅢ脂质体。

具体的，制备方法步骤为：

(1)将知母皂苷AⅢ溶液与膜材溶液混合，去除有机溶剂得到脂质薄膜；膜材包括(A)磷脂，(B)二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇；

知母皂苷AⅢ、磷脂和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇的摩尔比为1：8～10：0～2。

磷脂选自蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中的至少一种。

所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的分子量为2000～5000；二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇分子量为1000～5000。所述膜材溶液的浓度为20～150mg/mL。

优选的，知母皂苷AⅢ溶液浓度为0.5～4mg/mL；知母皂苷AⅢ溶液用甲醇、乙醇或氯仿配制，更优选为甲醇或乙醇。

膜材溶液用甲醇、乙醇或氯仿配制；其浓度为15～50mg/mL。

除去有机溶剂形成脂膜的方法为吹干法和减压旋转蒸发法中的一种。采用吹干法时，使用氮气或惰性气体，在15～40℃(室温或磷脂的相变温度)下吹干；采用减压旋转蒸发法时，温度为40～60℃，真空度为-0.09～-0.1MPa。

(2)加入磷酸盐缓冲液，40～60℃下水化30～120分钟，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液；所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.05～0.1mol/L，pH值为7.2～7.6；优选的，水化温度为45～50℃。

优选的，膜材与磷酸缓冲液的用量比为10～70mg：1mL。

(3)所述的知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液在40～60℃下超声处理，或者高压均质处理，获得知母皂苷AⅢ的纳米脂质体；

优选的，超声频率为40～100Hz，功率200～300W；优选的，超声处理条件为45～50℃下超声2～5次，每次3～5分钟。高压均质条件为：10000～30000PSI条件下循环2～6次；优选为，在10000～20000PSI条件下循环2～4次。

通过上述方法制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体外观呈均匀乳白色悬浮液，其平均粒径(D90)为25～80nm，Zeta电位范围-23～-35mV；包封率为75％～95％；pH值为7.3～7.4，载药率为5wt％～10wt％。

用上述方法所制备知母皂苷AⅢ脂质体在生理盐水中溶解度得到较好的改善，溶解度最高可达4mg/ml，相对于知母皂苷AⅢ在水中的溶解度提高了230倍左右；而且所得到的知母皂苷AⅢ脂质体稳定性高，不易泄露。

相对于知母皂苷AⅢ单体而言，本发明所制备知母皂苷AⅢ脂质体针对不同肿瘤细胞的增殖的抑制作用大大增强，其IC₅₀降低约一倍左右。

本发明所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体可应用于制备抑制肿瘤细胞增殖的药物；肿瘤细胞包括人黑色素瘤A375、66C14、B16-F10细胞、乳腺癌BT474细胞、人非小细胞肺癌细胞A549、肝癌HepG2、肠癌HCT-15、胃癌HGC-27，乳腺癌MCF-7、胰腺癌Panc-1或脑胶质瘤U87；尤其是可用于制备抑制人黑色素瘤A375、66c14、B16-F10细胞以及乳腺癌BT474细胞增殖的药物。在脑胶质瘤U87荷瘤裸鼠上的抑瘤效果高达54.1％，知母皂苷AIII脂质体抑瘤作用远强于知母皂苷AIII。

本发明所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体大鼠体内药物动力学研究显示，经尾静脉给药后，知母皂苷AⅢ的AUC(0-∞)相对原型药物提高2.13倍，体内滞留时间增加了3.7倍，说明知母皂苷AⅢ脂质体的制备可以提高药物体内的吸收度，同时能延长药物作用时间。

本发明通过简单的方法制备知母皂苷AⅢ纳米脂质体，原料易得，包封率高；所得到的知母皂苷AⅢ纳米脂质体稳定性好，水溶性明显改善，可显著提高知母皂苷AⅢ的体内吸收度，延长药物作用时间，而且提高了对肿瘤细胞增殖的抑制作用；尤其是解决了知母皂苷AⅢ在生物体内不能产生抑瘤效果的问题。知母皂苷AⅢ在脂质体内稳定性高，不易泄露。因此，这种知母皂苷AⅢ纳米脂质体可用于制备抑制肿瘤细胞增殖的药物，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1知母皂苷AⅢ纳米脂质体的透射电镜图。

图2～9为实施例1～8所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体的粒径分布图。

图10～17为实施例1～8所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体的Zeta电位图。

图18为知母皂苷AⅢ样品色谱图。

图19为实施例1所制备的知母皂苷AⅢ脂质体样品色谱图。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方1)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中；称取8.35mg蛋黄卵磷脂(EPC)溶于200μL氯仿溶液中，超声溶解。合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。EPC与知母皂苷AⅢ摩尔比为10:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45～50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液在超声频率为40-100Hz、功率200-300W的条件下超声3次，每次超声时间为3-5min，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例2、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方2)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中，称取8.53mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)溶于200μL氯仿溶液中，超声溶解。合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。DSPC与知母皂苷AⅢ摩尔比为10:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液于超声频率为40-100Hz，功率200-300W，超声3次，每次超声时间为3-5min，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例3、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方3)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中，称取7.51mg蛋黄卵磷脂(EPC)、3.02mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶于500μL氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。EPC、DSPE-PEG2000和知母皂苷AⅢ的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液于超声频率为40-100Hz，功率200-300W，超声3次，每次超声时间为3-5min，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例4、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方4)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中，称取7.68mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、3.02mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶于200μL氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。DSPC、DSPE-PEG2000和知母皂苷AⅢ的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃下减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液于超声频率为40-100Hz，功率200-300W，超声3次，每次超声时间为3-5min，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例5、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方5)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中，称取7.51mg蛋黄卵磷脂(EPC)、5.40mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000)溶于500μL氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。EPC、DSPE-PEG5000和知母皂苷AⅢ的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液于超声频率为40-100Hz，功率200-300W，超声3次，每次超声时间为3-5min，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例6、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方6)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中，称取7.67mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、5.40mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000)溶于200μL氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。DSPC、DSPE-PEG5000和知母皂苷AⅢ的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液于超声频率为40-100Hz，功率200-300W，超声3次，每次超声时间为3-5min，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例7、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方7)

称取400mg知母皂苷AⅢ溶于200ml甲醇中，称取3755mg蛋黄卵磷脂(EPC)、1510mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶于250ml氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底烧瓶中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底烧瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。EPC、DSPE-PEG2000和知母皂苷AⅢ的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入100ml 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45～50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ粗悬液于高压均质仪中分散，20000PSI条件下循环3次，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

实施例8、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方8)

称取400mg知母皂苷AⅢ溶于200ml甲醇中，称取3835mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1510mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶于100ml氯仿溶液中，超声溶解，合并上述溶液于圆底烧瓶中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底烧瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。DSPC、DSPE-PEG2000和知母皂苷AⅢ的摩尔比为9:1:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入100ml 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ粗悬液于高压均质仪中分散，20000PSI条件下循环3次，即得到知母皂苷AⅢ纳米脂质体。

对照例1、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方9)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中；称取2.51mg蛋黄卵磷脂(EPC)溶于60μL氯仿溶液中，超声溶解。合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。EPC与知母皂苷AⅢ摩尔比为3:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45～50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液在超声频率为40-100Hz、功率200-300W的条件下超声3次，每次超声时间为3-5min，所得到的混合液容易形成沉淀，不能形成均匀的脂质体悬浮液。

对照例2、知母皂苷AⅢ纳米脂质体制备(处方10)

称取0.8mg知母皂苷AⅢ溶于400μL甲醇中，称取2.56mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)溶于60μL氯仿溶液中，超声溶解。合并上述溶液于圆底具塞试管中，氮气吹干除去甲醇和氯仿，直至圆底试管壁上形成一层均匀的脂质薄膜。DSPC与知母皂苷AⅢ摩尔比为3:1。-0.09MPa、45～50℃减压干燥除去残留溶剂和水分，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，45-50℃水浴条件下水化1小时，得到知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液。将知母皂苷AⅢ脂质体粗悬液于超声频率为40-100Hz，功率200-300W，超声3次，每次超声时间为3-5min，所得到的混合液容易形成沉淀，不能形成均匀的脂质体悬浮液。

实施例9、知母皂苷AⅢ纳米脂质体的质量评价

9.1形态观察

取实施例1～8所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释至较低浓度，滴于铜网上，用滤纸吸干多余的液体，醋酸铀染色3min，染色三次后于透射电镜下观察产物的形态。实施例1～8所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体呈圆形或椭圆形微球体，颗粒间分散、独立，且粒径＜100nm。实施例1的知母皂苷AⅢ纳米脂质体如透射电镜图图1所示。对照例1、2所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体发生沉淀，未形成均匀的脂质体悬浮液，其粒径大于1000nm。

9.2溶解度测定

采用HPLC测定知母皂苷AⅢ在不同饱和溶液中的溶解度及脂质体(处方1)中溶解度，由表1可见，知母皂苷AⅢ在水中的溶解度为0.017mg/ml，在脂质体中溶解度为4.00mg/ml，溶解度提高了230倍。

表1知母皂苷AⅢ脂质体的质量评价结果

9.3粒径与Zeta电位测定

取适量知母皂苷AⅢ纳米脂质体，以0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释至脂质体脂浓度为1mmol/L，采用Malvern Zeta电位仪测定其粒径与Zeta电位。采用上述方法分别测定实施例1-8所制备的脂质体的粒径和电位。测得粒径范围为：45.1-69.5nm(D90)，Zeta电位范围为：-24.8--31.8mV，其粒径分布图如图2～9所示，Zeta电位图如图10～17所示。实验结果见表2。

9.4pH值：取实施例1～8所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体检测pH值，测定结果为7.35±0.04。

9.5包封率与载药率的测定：采用HPLC-ELSD测定脂质体中知母皂苷AⅢ的含量。

9.5.1色谱条件

Agilent 1100型高效液相色谱仪(配Alltech3300蒸发光散射检测器；色谱柱为Alltima^TM C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(85：15)；流速：1mL/min；进样量20μL；光散射检测器温度为60℃，雾化气体流速为1.5L/min。知母皂苷AⅢ及脂质体样品色谱图见图18、19。

9.5.2标准曲线的绘制

精密称取22.6mg知母皂苷AⅢ标准品，用甲醇溶解并定容至10mL，得到2.26mg/ml，分别稀释至浓度为56.5、113、226、452、904、1130μg/mL的对照品溶液，分别注入液相色谱仪，进样量为20μL，以知母皂苷AⅢ峰面积平均值的常用对数为纵坐标，对照品浓度的常用对数为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程得：y＝1.3764x-1.6816，r＝0.9995。表明知母皂苷AⅢ在56.5～1130μg/mL范围内其浓度的常用对数与峰面积的常用对数呈良好的线性关系。

9.5.3知母皂苷AⅢ纳米脂质体中知母皂苷AⅢ的含量测定

准确移取知母皂苷AⅢ纳米脂质体20μL，加入180μL甲醇，涡旋混匀5mins，14000rpm/min离心5mins，取上清液进样测定。

9.5.4包封率与载药率的测定

取20μL知母皂苷AⅢ纳米脂质体，采用HPLC测定其质量浓度C1。另取50μL纳米脂质体于分子截留量为8000-14000D的透析袋中，置于1000mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中透析24h。取出透析后的纳米脂质体，测定体积V2，并精密移取20μL透析后的知母皂苷AⅢ纳米脂质体，采用HPLC测定袋内脂质体内知母皂苷AⅢ的浓度C2。计算其包封率EE(％)＝C2*V2/C1*50×100％。

载药率的测定：取200μL纳米脂质体，冻干后称定其质量为W1，并按上述方法测定其中知母皂苷AⅢ的重量W2，其载药率DL(％)＝W2/W1×100％。分别计算实施例1-8所制备的脂质体的包封率和载药率，结果见表2。

表2知母皂苷AⅢ纳米脂质体的质量评价结果

结论：实例1-8制备的知母皂苷AⅢ脂质体包封率范围为：78.3％～93.1％。优选处方制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体包封率均在75％以上，均高于对照例1和2所制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体。制备的纳米脂质体载药率均高于5％。

9.6知母皂苷AIII纳米脂质体初步稳定性实验

将制备的知母皂苷AⅢ纳米脂质体(处方1)于4℃冷藏条件下放置3个月，以脂质体的外观形态、粒径及包封率变化为指标考察其稳定性。

表3知母皂苷AⅢ纳米脂质体初步稳定考察

结果表明，在4℃冷藏条件下放置3个月后，知母皂苷AⅢ脂质体外观形态、粒径及包封率变化均不明显，表明知母皂苷AⅢ脂质体稳定性良好。

处方2-8的知母皂苷AⅢ纳米脂质体在4℃冷藏条件下放置3个月后，外观形态、粒径及包封率同样无明显变化。

9.7体外抗肿瘤活性测定：

分别采用人黑色素瘤A375、66c14、B16-F10细胞，乳腺癌BT474细胞，人非小细胞肺癌细胞A549、肝癌HepG2、肠癌HCT-15、胃癌HGC-27，乳腺癌MCF-7、胰腺癌Panc-1，购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，脑胶质瘤U87，购自于上海奥陆生物科技有限公司。该细胞株培养体系为DMEM培养液(GIBCO)90％，优质胎牛血清10％。5％二氧化碳，温度37℃。0.25％胰蛋白酶、0.02％EDTA消化液传代。

9.7.1接种

分别取处于指数生长期的肿瘤细胞，用含有10％胎牛血清的DMEM培养液稀释成1×10⁶、4×10⁵、1×10⁵、1×10⁵细胞/ml。96孔板每孔中加入50μL细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

9.7.2培养

96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h。

9.7.3加药

知母皂苷AⅢ：将知母皂苷AⅢ用DMSO配制成储备液，用DMEM培养液(含10％FBS)配制各浓度工作液(3.8、7.7、15.4、20.5、30.754、41.0、54.7、109.4、164.0、218.7μM)，每孔中加入50μL以上各液体，设3个复孔。各组终浓度分别为1.9、3.8、7.7、10.3、15.4、20.5、27.3、54.7、82、109.4μM。同时设置空白组和对照组，其中空白组是以等体积的培养液代替细胞溶液，对照组是以等体积的PBS缓冲溶液代替知母皂苷AⅢ溶液加入其中。

知母皂苷AⅢ脂质体：将知母皂苷AⅢ脂质体用DMEM培养液(含10％FBS)配制各浓度工作液(5.9、11.9、23.7、31.6、47.4、63.3、84.3、168.7、253.0、337.4μM)，每孔中加入50μL以上各液体，设3个复孔。各组终浓度分别为3.0、5.9、11.9、15.8、23.7、31.6、42.2、84.3、126.5、168.7μM。同时设置空白组和对照组，其中空白组是以等体积的培养液代替细胞溶液，对照组是以等体积的PBS缓冲溶液代替知母皂苷AⅢ溶液加入其中。

9.7.4孵育

置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h。

9.7.5加MTT

MTT用磷酸缓冲液配成5mg/ml溶液，在培养结束前5h，每孔中加入20μL，置于37℃、5％C0₂孵箱中继续孵育。

9.7.6测定

培养结束后弃去细胞上清液，每孔加入100μL DMSO溶解结晶产物。用酶标仪读取490nm波长OD值。记录知母皂苷AⅢ对各种细胞增殖的抑制率。

抑制率(％)＝(A490,_Control-A490,_样品)/(A490,_Control-A490,_Blank)×100％抑制率(％)＝(A490,_对照-A490,_样品)/(A490,_对照-A490,_空白)×100％

根据不同浓度的知母皂苷AⅢ及知母皂苷AⅢ脂质体(实施例1～4的方法制备，用知母皂苷TAⅢ纳米脂质体1～4表示)对各种肿瘤细胞增殖的抑制率，采用SPSS 18.0计算IC50，见表4、5。

表4知母皂苷AⅢ脂质体的质量评价结果

T检验：*与知母皂苷AⅢ组比较，P<0.05；**与知母皂苷AⅢ组比较，P<0.01。

表5知母皂苷AⅢ脂质体的质量评价结果

结果表明：知母皂苷TAIII脂质体能够提高药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

9.7知母皂苷AⅢ及其脂质体对脑胶质瘤U87皮下荷瘤裸鼠抑瘤作用

18只裸鼠，体重18-20g左右，饲养于SPF环境中，裸鼠食料、饮用水、垫料均定期经高压灭菌消毒，鼠笼、垫料一周更换一次。裸鼠造模后随机分为4组：生理盐水组，知母皂苷AⅢ腹腔注射治疗组(60mg/Kg)，知母皂苷AⅢ脂质体腹腔注射治疗组(以知母皂苷AⅢ计为60mg/Kg)，正常对照组，每组5只。

显微镜下观察脑胶质瘤U87细胞处于对数生长期时，状态好，无污染，胰酶消化，制备成细胞悬液(浓度2×10⁷个/ml)。正常对照组不做种瘤操作。其他三组向每只裸鼠右侧前腋下接种0.1ml的U87细胞悬液,细胞接种量均为2×10⁶个/ml。肿瘤接种当天记为第0天。一周后可以触及肿瘤小块，分为三组：生理盐水组，知母皂苷AⅢ腹腔注射治疗组(60mg/Kg)，知母皂苷AⅢ脂质体腹腔注射治疗组(60mg/Kg)，以实例8制备的脂质体进行实验。生理盐水组为每次腹腔注射0.1ml的9％生理盐水；知母皂苷AⅢ腹腔注射治疗组(60mg/Kg)：取知母皂苷AⅢ混悬液，腹腔注射，给药剂量60mg/Kg，隔天给药1次；知母皂苷AⅢ脂质体腹腔注射治疗组(60mg/Kg)：取知母皂苷AⅢ脂质体溶液，腹腔注射，给药剂量60mg/Kg，隔天给药1次；观察18天，观察给药期间和给药结束后连续记录裸鼠存活情况、体重变化、肿瘤大小、精神状态等指标。18天后，处死所有裸鼠，取瘤称重，计算瘤重指数，抑瘤率。瘤重指数＝肿瘤重量/裸鼠重量×l00％，抑瘤率＝l-实验各组平均瘤重指数/生理盐水组平均瘤重指数×l00％，各组实验结果以mean士SD表示，统计比较采用t检验，P值小于0.05为具有显著统计学差异。实验结果如表6。

表6知母皂苷AⅢ体内抗肿瘤活性实验结果

结果表明，知母皂苷AⅢ虽然细胞实验抑制肿瘤细胞增殖作用很强，但是整体动物实验结果表明，知母皂苷AⅢ药物对脑胶质瘤皮下荷瘤裸鼠的抑瘤效果并不明显，而知母皂苷AⅢ脂质体抑瘤效果高达54.1％，表明知母皂苷AⅢ脂质体可以增强药物本身知母皂苷AⅢ的药效作用。

实施例10、知母皂苷AⅢ纳米脂质体与知母皂苷AⅢ大鼠体内药物动力学差异研究

SD大鼠10只，180-200g，随即分为2组，分知母皂苷AⅢ与其纳米脂质体给药组，大鼠一次性尾静脉注射知母皂苷AⅢ或其脂质体(处方4)10mg/kg(以知母皂苷AⅢ实际含量计算)，按1mL/l00g尾静脉注射。给药前眼眶取血作为空白样品，给药后于预先设定时间(2、5、10、30min、1、2、4、6、8、12、24、48、72h)眼眶采血，每次取血0.2mL左右至肝素化样品管中，离心(5000r/min)5min制备血浆，按血浆样品预处理方法处理样品，采用HPLC-MS/MS测定血浆中知母皂苷AⅢ的浓度，DAS程序进行知母皂苷AⅢ的动力学分析，并求算药代动力学参数，比较知母皂苷AⅢ及其脂质体在大鼠体内药代动力学差异，结果见表7。

表7知母皂苷AⅢ纳米脂质体与知母皂苷AⅢ大鼠体内药物动力学参数结果

结果表明，知母皂苷AⅢ脂质体大鼠尾静脉给药，体内药物AUC(0-∞)是知母皂苷AⅢ的2.13倍，体内滞留时间增加了3.7倍，说明知母皂苷AⅢ脂质体的制备可以提高药物体内的吸收度，同时能延长药物作用时间，也进一步佐证了知母皂苷AⅢ脂质体抗肿瘤药效强于知母皂苷AⅢ原型药物。