β‑1,6‑六羟基联苯二甲酰基‑2,3,4‑三没食子酸基‑D‑葡萄糖化合物在制备药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及化合物的新用途，尤其涉及β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物在制备预防/治疗糖尿病及其相关并发症药物中的应用。

背景技术：

现代社会以及高脂、高糖饮食为特点的生活饮食习惯使得人群中血糖、血胰岛素水平异常患者激增；如得不到有效防治，必然引起机体多系统的损害，例如：胰岛受损导致的胰岛素分泌不足，靶组织细胞对胰岛素敏感性的下降，蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合症等，最常见的疾病为Ⅱ型糖尿病。有关资料表明，糖尿病己成为继心脑血管疾病、肿瘤之后，严重威胁人类健康的第三大疾病，预计到2025年，全球糖尿病患者将突破3亿(王双慧，燕麦β-葡聚糖对糖调节受损(IGR)小鼠血脂和抗氧化能力的影响研究[D].重庆大学，2014)。另外，糖尿病病人容易出现脂蛋白和血脂的异常情况，Ⅱ型糖尿病病人中约有超过60％存在血脂异常的现象，但是，只有少数患者能够在早期诊断出来并得到有效治疗。慢性并发症还可导致糖尿病患者病残或过早死亡。据统计，Ⅰ型糖尿病患者中有50％死于慢性肾功能衰竭，而Ⅱ型糖尿病也有5％-10％死于肾功能衰竭(中国当代医疗百科专家专著编委会编著.糖尿病防治保健手册.北京：中医古籍出版社,2006.12)。

ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂通过可逆性抑制小肠刷状缘上的ɑ-葡萄糖苷酶，保持餐后血糖稳定，减少餐后血糖大幅波动对胰腺的刺激，改善机体高糖环境造成的外周组织胰岛素敏感性的降低。大量临床数据表明，ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂可用于调节糖、脂代谢、改善高胰岛素血症、糖耐量异常，并且能有效预防并改善糖尿病大血管及微血管并发症的发生和发展，对治疗和预防糖尿病及血管并发症等具 有重要的作用(Dinicolantonio JJ et al.Acarbose:Safe and Effective for Lowering Postprandial Hyperglycaemia and Improving Cardiovascular Outcomes[J].Open Heart，2015)。糖尿病属于慢性疾病，治疗周期较长，甚至可能终身服药；再者近年来，临床应用发现，阿卡波糖为代表的ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂可导致胃肠道紊乱、肝损害、过敏等不良反应的出现；因此，研制成本低廉、安全有效的降糖药物是关注的要点。

中药作为中华民族的瑰宝，未病先防、既病防变，具有多途径、多靶点、多向性的药理特点，作用温和持久且能有效延缓并发症的发生。以多酚类为例，该类化合物具有多种生理功能，诸如改善心血管疾病、防癌、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗高血糖、降血脂、调节抗氧化酶系的表达及抗炎等多种生理功能。多酚类物质五没食子酰基葡萄糖广泛存在于天然药物中，诸如五倍子、牡丹皮、白芍、赤芍、黄芩等中；该类化合物药理活性广泛，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血管再生、抗衰老等作用。据报道，五没食子酰基葡萄糖具有缓解胰岛素抵抗、抑制ɑ-葡萄糖苷酶及11β羟化固醇脱氢酶1型、减少胰岛淀粉样多肽、糖基化终末产物的沉积，模拟胰岛素、刺激葡萄糖转运，减缓糖尿病肾病、糖尿病神经病变及血管病变等作用(张建博等.五没食子酰基葡萄糖治疗Ⅱ型糖尿病及其并发症药效机制研究进展[J].药学研究，2015)。五没食子酰基葡萄糖在治疗Ⅱ型糖尿病及其并发症方面的研究报道，给予天然药物研究者重要的启示。

化合物Davidiin(β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖)可以从植物珙桐、头花蓼分离得到。其在药材头花蓼中含量在1％左右，且有抗肝癌(Wang Y et al.A potential antitumor ellagitannin,davidiin,inhibited hepatocellular tumor growth by targeting EZH2[J].Tumour Biol，2014)、抑制SUMO蛋白质修饰化(M Takemoto et al.Inhibition of Protein Sumoylation By Davidiin,an Ellagitannin From Davidia Involucrata[J].The Journal of Antibiotics，2014)并能抑制阿片受体、多巴胺2受体、ɑ2肾上腺素受体、β肾上腺素受体活性(Zhu M et al.Plant Polyphenols:Biologically Active Compounds Or Non-selective Binders to Protein[J].Phytochemistry，1997)等作用。本发明人惊喜地发现β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物具有降血糖、降血脂、防治糖尿病肾 脏病变的新功能，因而，宜进一步开发新的适应症药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于研究设计β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物在制备抗糖尿病、高血脂及慢性肾损伤等并发症中药物的新用途。

本发明提供了β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物在制备预防/治疗糖尿病及其相关并发症药物中的应用。

本发明所述与糖尿病相关并发症为高血脂或慢性肾损伤的病症。

本发明提供了β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物在制备预防/治疗糖尿病相关高血脂药物中的应用。

本发明提供了β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物在制备预防/治疗糖尿病相关慢性肾损伤药物中的应用。

本发明所述β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物通过从中药头花蓼中分离纯化所得。

所述β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物的英文名为Davidiin，结构式为：

本发明人进行了β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物的糖尿病动物模型试验，证实化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物具有降血糖、降血脂以及防治糖尿病肾脏病变功能。α-淀粉酶活性抑制实验显示β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物对α-淀粉酶具有显著的抑制效果。小鼠淀粉耐量 实验结果：给药前，各实验组小鼠体重没有显著性差异；给药后，与对照组比较，化合物低、中、高剂量组灌胃给药能显著降低小鼠的餐后血糖，并且高、中、低三剂量组呈现一定的量效关系。由此说明，β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物对高血糖具有治疗作用。β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物(Davidiin)对链脲菌素糖尿病大鼠的糖、脂代谢及糖尿病肾脏病变的影响试验，结果显示其能够降低餐后血糖水平，改善受损葡萄糖耐量，阻滞血红蛋白蛋白的糖基化、降低胰岛素抵抗、促进胰岛细胞再生，缓解氧化应激压力，长期服用还能够改善糖脂代谢、延迟或防治肾病变的发生和发展。因此，β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物可用于制备预防/治疗糖尿病相关高血脂药物。

本发明提供了从中药头花蓼中分离纯化制备β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物的方法。

该方法包括下列步骤：

(1)取头花蓼药材粉碎，先以2-4倍于药材的50％-70％乙醇W/L浸润12h，然后渗漉提取，流速为1.5BV/h，TLC薄层板检测提取完全，收集渗漉液，减压浓缩(55℃，0.08-0.1MPa)至无醇味得提取液，取提取液依次用0.5-1.5倍于药材体积的石油醚萃取1-3次，弃除萃取液，萃取后的水部位再用0.5-1.5倍于药材体积的乙酸乙酯萃取1-3次，弃除萃取液，将萃取后的水部位再用0.5-1.5倍于药材体积的正丁醇萃取1-3次，收集萃取液，减压浓缩(55℃，0.08-0.1MPa)得正丁醇浸膏，然后取正丁醇浸膏加入1倍于浸膏重量的水W/L混悬后通过大孔树脂柱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱，洗脱液为柱体积的10倍～15倍，分别得到水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱液，分别减压浓缩(55℃，0.08-0.1MPa)至无醇味的浸膏；(2)取上述30％乙醇洗脱液浸膏，用体积比为1:1的甲醇：水溶解，经MCI～CHP20P凝胶柱色谱，以体积比为的1:9～1:0甲醇：水梯度洗脱，TLC薄层板检测，得到7个流份Fr₁-Fr₇；取流份Fr₃经凝胶柱LH-20体积比为1:9～1:0的甲醇：水体积比为1:9～1:0梯度洗脱纯化2次，减压浓缩(55℃，0.08-0.1MPa)至棕黄色晶型粉末，得β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物。

经各波谱数据解析确认结构为化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，高效液相色谱法检测，纯度为98.1％。

本发明所述药物为由β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。

现有研究仅提供β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物具有一定的抗肿瘤作用等；但是均未有该化合物用于糖尿病、高血脂及相关并发症研究作用方面的报道。本发明首次公开了所述化合物具有降血糖、降血脂以及防治糖尿病肾脏病变的功能，为防治糖尿病提供了新的药物。中药头花蓼来源丰富，分离纯化工艺简单，成本低，药物无副作用，安全性好，具有较大的临床应用价值。

附图说明

图1不同药物浓度的α-淀粉酶抑制率(实施例2)

Davidiin；阿卡波糖

横坐标：浓度(单位μg/ml)；纵坐标：抑制率(单位％)

图2药物治疗对大鼠胰岛组织病理的影响(HE，×400)(实施例4)

A:正常对照组大鼠(Normal control)B：糖尿病模型组(Diabetic control)

C：阿卡波糖组(Diabetic+acarbose)D：Davidiin低剂量组(Diabetic+5mg/kg*d)

E：Davidiin中剂量组(Diabetic+15mg/kg*d)F：Davidiin高剂量组(Diabetic+45mg/kg*d)

具体实施方式

实施例1化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)的制备

取市售头花蓼药材20kg，粉碎，先以40L的70％乙醇浸润12h，然后渗漉提取，流速为1.5BV/h(BV为药材重量)，TLC薄层板检测是否提取完全，收集渗 漉液，减压浓缩(55℃)至无醇味得粗提物浸膏(相对密度为1.1～1.2)；每次用10L的石油醚萃取，萃取液为石油醚部位、萃取后的残留液再用20L的乙酸乙酯萃取，萃取液为乙酸乙酯部位、再将萃取后的残留液用10L的正丁醇萃取，萃取液为正丁醇部位，分别萃取2次，TLC薄层板检测是否萃取完全；取正丁醇部位减压浓缩(55℃)得正丁醇浸膏，称其重量为1012g，得率为5.06％，然后取正丁醇浸膏500g加入500mL的水混悬后通过D-101型大孔树脂柱，依次用10L的水、8L的10％乙醇、8L的30％乙醇、5L的50％乙醇、5L的70％乙醇和8L的95％乙醇洗脱，分别得到水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇洗脱液，分别减压浓缩(55℃)至无醇味的浸膏(相对密度为1.12～1.18)，称其重量分别为172g、105g、31g、41g、58g和87g。

取上述其中30％乙醇洗脱液浸膏，用50mL的甲醇：水(1:1)的混合溶液溶解，经MCI～CHP 20P凝胶柱色谱，以甲醇：水1:9～1:0梯度洗脱，TLC薄层板检测，得到7个流份(Fr₁-Fr₇)。流份Fr₃经凝胶柱(LH-20)甲醇：水体积比为1:9～1:0梯度洗脱纯化2次，55℃条件下减压浓缩至棕黄色晶体，即为目标化合物(1083mg)。

经各种波谱数据解析确认结构为化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)

ESI-MS m/z 937.10[M-H]⁺；

棕黄色晶体；

ESI-MS m/z:953.1[M+Na]⁺；IR:3047,1724,1620,1536,1454；

¹H-NMR(600MHz，CD₃OD，δppm):6.69(1H,d,J＝3.0Hz,H-1),5.42(1H,dd,J＝3.0,8.0Hz,H-2),5.72(1H,d,J＝8.0Hz,H-3),5.10(1H,s,H-4),4.38(1H,m,H-5),5.32(1H,d,J＝13.0Hz,H-6),4.03(1H,d,J＝13.0Hz,H-6),6.57,7.06,7.24(2H,s,H-2'/H-2”),6.87(2H,s,H-2”'/H-6”'),6.89(2H,s,H-2””/H-6””),6.94(2H,s,H-2””'/H-6””')；

¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD，δppm):65.6(C-6),70.8(C-2),75.1(C-3),74.4(C-4),77.8(C-5),90.5(C-1),165.9,166.4,166.8,167.4,167.9(-COO-),117.1 (C-1'),118.2(C-1”),120.4(C-2'),124.6(C-2”),109.1(C-3'),112.5(C-3”),145.4(C-4'),145.8(C-4”)137.0(C-5'),138.8(C-5”),145.8(C-6'),146.2(C-6”),121.6(C-1”'/C-1””/C-1””'),110.3(C-2”'/C-2””/C-2””'),144.5(C-3”'/C-3””/C-3””'),139.8(C-4”'/C-4””/C-4””'),144.8(C-5”'/C-5””/C-5””'),110.8(C-6”'/C-6””/C-6””').

高效液相色谱法检测，纯度为98.1％。

实施例2化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖化合物(Davidiin)α-淀粉酶活性抑制实验

1.实验用品

α-淀粉酶：美国sigma公司；

二甲基亚砜：上海博光生物科技有限公司；

阿卡波糖：德国Bayer公司；

酶标仪：美国Bio-Tek公司；

化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，由实施例1制备

其他所用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

2.实验方法

一系列不同浓度的待测样品溶液25μl，再加入12.5μlα-淀粉酶溶液(含量为27.8mg/L，25mM的PIPES缓冲液配制而成，PH6.9)，37℃温孵10min，向体系中加入12.5μl浓度为0.16％的淀粉溶液，37℃温孵，在10min结束时向体系中加入100μl显色试剂，同时终止反应，在630nm波长下测定吸光度(A)，反应剩余显色试剂的量反映被酶水解的淀粉的量，直接反映淀粉酶的活性。阿卡波糖作为本法的阳性对照，同时设定空白对照，酶活性对照。抑制率(％)计算公式如下：

抑制率(％)＝[1-(样品withoutE-样品withE)/(对照withoutE-对照withE)]×100％

见图1不同药物浓度的α-淀粉酶抑制率

Davidiin；阿卡波糖

横坐标：浓度(单位μg/ml)；纵坐标：抑制率(单位％)

3.实验结果

β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖对α-淀粉酶具有显著的抑制效果，呈剂量依赖型，随着其浓度的增加，酶的抑制活性也随之增强。IC50值为124.7μg/ml，95％置信区间116.3～133.7，效果优于同浓度的阿卡波糖(阿卡波糖IC50值为327.1μg/ml，95％置信区间291.9～366.5。

实施例3化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)小鼠淀粉耐量实验

1.材料与方法

1.1实验材料

阿卡波糖(拜耳，50mg/片)，玉米淀粉(一招鲜，袋装，458g)，血糖测定试纸(Major Ⅱ)

1.2实验动物

ICR小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2012-0002；体重：20g左右；性别：雄性；每组10只)。

1.3实验药物

化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，由实施例1制备；临用前，化合物烘干(50～60℃环境下烘干至恒重)，然后分别精密称取化合物50mg、100mg、200mg，加入10ml0.5％羧甲基纤维素钠，分别配成浓度为5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml的悬浮液与2.5g/kg淀粉等体积混合后，作为化合物低、中、高剂量组，其化合物的浓度分别为2.5mg/ml、5mg/ml和10mg/ml。

1.4给药方法

给药体积均为0.1ml/10g体重，对照组给等体积的淀粉，全部采用灌胃法给药。确定化合物给药量分别为25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg。

1.5实验方法

将50只ICR小鼠随机分成5组，在适应性饲养2-3天后，称取体重，按体重随机分组(每组体重相等)，每组10只。撤除食物及垫料饥饿12h，分为对照组、阳性对照组(阿卡波糖，给药剂量25mg/kg)，Davidiin低、中、高剂量组，然后一起灌胃给药。给糖前测定血糖，在给糖后30min，60min，120min时各测

定血糖一次，然后计算AUC(area under the curve)，计算公式如下：

注：BG:blood glucose血糖

实验数据采用spss16.0进行统计分析，组间多项数据比较采用单因素方差分析，数据以表示，P＜0.05作为显著性差异。

2.实验结果

2.1小鼠各组体重情况，见表1

表1给药前小鼠的体重情况(数据以均数表示，g，n＝10)

2.2小鼠给糖前(0min)，给糖后30min、60min、120min的血糖及AUC值见表2。

表2单体化合物灌胃后小鼠餐后血糖(mg/dl,n＝10,)

注：给药组与对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

3.结论

给药前，各实验组小鼠体重没有显著性差异；给药后，与对照组比较，化合物低、中、高剂量组灌胃给药能显著降低小鼠的餐后血糖，并且高、中、低三剂量组呈现一定的量效关系。因此化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖对高血糖具有治疗作用。

实施例4化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)对链脲菌素糖尿病大鼠的糖、脂代谢及糖尿病肾脏病变的影响

1.材料与方法

1.1实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重170-190g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号SCXK(沪)2013-0016。饲养于第二军医大学屏障环境动物实验室，室温20℃，相对湿度45％左右，光暗周期(12h/12h)，实验期间，动物自由进食水。

1.2实验药物

化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖(Davidiin)，由实施例1制备；临用时用0.5％的羧甲基纤维素钠溶液配成相应浓度的混悬液。

阿卡波糖片(拜糖平)：拜耳医药保健有限公司，国药准字H19990205，批号BJ24830；动物灌胃使用前用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制成所需浓度溶液。

1.3主要试剂及仪器

高脂饲料：上海普路腾生物科技有限公司；许可证号为沪饲证(2014)04001；

羧甲基纤维素：生工生物工程(上海)股份有限公司；批号：AA27BA0024；

二水合柠檬酸三钠：国药集团化学试剂有限公司；批号：20150629；

一水合柠檬酸：国药集团化学试剂有限公司；批号：20150804；

链脲佐菌素：上海源叶生物科技有限公司；批号：NO2N6Q5278；

茂晶血糖测试片(Major Ⅱ)：茂晶生技股份有限公司；批号：5707787277；国食药监械(许)字2400021号；

葡萄糖测定试剂盒：上海荣盛生物药业有限公司；批号：20151105147

SOD测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151224；

丙二醛(MDA)测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151225；

肌酐(Cr)测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151218；

总胆固醇测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151225；

甘油三酯测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151226；

高密度脂蛋白测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151225；

低密度脂蛋白测试盒：南京建成生物工程研究所；批号：20151226；

大鼠糖化血红蛋白试剂盒：美国RB进口分装；货号：DRE20948；批号：201512；

大鼠肿瘤坏死因子α：美国RB进口分装；货号：DRE20040；批号：20151226；

大鼠胰岛素：美国RB进口分装；货号：DRE20732；批号：20151226；

茂晶血糖测试仪：茂晶生技股份有限公司；

Screen Master 3000双通道半自动生化分析仪：hospitex公司；

多功能酶标仪：Tecan公司；

洗板机：Thermo Labsystems公司；

移液器：吉尔森P型移液器(Pipetman)

1.2实验方法

1.2.1动物造模

雄性Wistar大鼠75只，适应性词养1周，随机抽取10只作为正常组，普通饲料饲养；其余65只大鼠采用高脂饲料(基础饲料59.75％，酪蛋白19％，猪油10％，蔗糖10％，胆固醇1％，胆盐0.25％，普通及高脂饲料均购于上海斯莱康有限公司)。

饲养2周后，高脂饲料饲养组动物禁食12h，链脲佐菌素(STZ)按35mg/kg给大鼠腹腔注射，普通词料饲养组大鼠同时注射等体积的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液，1w后测定各动物随机血糖及空腹血糖(禁食时间8:00-14:00)，随机血糖值≧200mg/dl且空腹血糖值≧126mg/dl的动物视为模型成功。

1.2.2动物分组

将符合糖尿病模型要求的大鼠50只，按血糖、体重随机分为5组，每组10只大鼠，分别为糖尿病模型组(Diabetic control)、阿卡波糖组(Diabetic+acarbose)、Davidiin低剂量组(Diabetic+5mg/kg*d)、Davidiin中剂量组(Diabetic+15mg/kg*d)、Davidiin高剂量组(Diabetic+45mg/kg*d)；上述5组以高脂饲料继续饲养4周。另有正常对照组大鼠(Normal control)10只。

1.2.3标本制备

给药4周后，各组大鼠禁食，然后经腹腔注射水合氯醛(400mg/kg)麻醉，分离腹主动脉并取血，取1ml加入抗凝管中(用作测定糖化血红蛋白)；其余血标本，肝素抗凝，3000rpm/min离心15min。取上清分装保存，用于其他指标检测。大鼠采血后，暴露胰腺和肝脏，迅速将胰腺周围的组织分离干净，取下整个胰腺，从胰头部迅速剪取约1mm3的胰腺组织，生理盐水冲洗干净，浸泡于固定液中。

1.2.4指标检测

于给药后每周(0、1、2、3、4周)的同一时间记录大鼠的一般状态，包括实验大鼠的精神状态、毛色、体重、摄食量、尿量等情况；测定动物给药0、1、2、3、4周随机血糖；给药三周后，各组大鼠进行葡萄糖耐量实验；血浆甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血糖、胰岛素、SOD、MDA、肌酐等生化指标及糖化血红蛋白、TNF-α。

1.3统计学分析

采用spss 16.0软件(美国IBM公司)进行处理分析，测定数值均以平均值±标准差表示，均数间比较采方差分析检验，p<0.05为有统计学意义。

2.结果

2.1大鼠一般情况观察

正常对照组大鼠体重增加明显，精神状况良好，毛皮有光泽，动作自如，反应灵敏。糖尿病模型组大鼠精神逐渐萎靡、明显消瘦、多尿、多饮、毛竖无光泽；治疗组精神状况良好，较正常对照组稍差。

2.2大鼠血糖水平的变化

分别于给药1周、2周、3周、4周，测各组大鼠非禁食血糖(9:30AM)，结果见表3。高脂饲料饲养联合链脲佐菌素可致使大鼠非禁食血糖水平显著增高(p<0.01)；Davidiin给药能够降低高血糖大鼠非禁食血糖，并呈现剂量关系；与糖尿病模型组比较，Davidiin中剂量组给药3周、4周后显著降低非禁食血糖水平(p<0.05)；Davidiin高剂量组给药2周后，非禁食血糖较模型对照组显著下降(p<0.05)，给药3周、4周后血糖下降非常显著(p<0.01)。

表3药物治疗对大鼠非禁食血糖的影响(mg/dl，)

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组比较

2.3给药对大鼠糖耐量异常的改善

给药3周后，大鼠禁食不禁水12h，进行口服葡萄糖耐量实验，结果见表4；糖尿病模型组大鼠的空腹血糖和糖负荷后各测定时间点血糖水平显著高于正常对照组，差异非常显著(p<0.01)；与糖尿病模型组比较，阿卡波糖组大鼠葡萄糖负荷后各时间点血糖水平下降非常显著(p<0.01)，但空腹血糖(0min)无显 著差异；Davidiin给药明显改善糖耐量异常，降低空腹血糖，并改善糖负荷后各时间点的血糖水平，各剂量均能显著降低糖负荷后血糖曲线下面积，并呈现剂量关系；与糖尿病模型组比较，Davidiin高剂量组灌胃葡萄糖后30min、60min血糖水平降低非常显著(p<0.01)，120min血糖水平降低显著(p<0.05)，糖负荷后血糖曲线下面积降低非常显著；与阿卡波糖组不同的是，Davidiin高剂量组能非常显著的降低空腹血糖水平(p<0.01)。

表4药物治疗对于糖耐量异常的影响(mg/dl，)

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组比较

2.4给药对大鼠糖化血红蛋白的影响

给药4周后，处死动物，血液样本测定各组大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)水平，结果见表5。与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型组大鼠糖化血红蛋白显著升高(p<0.05)，给药组糖化血红蛋白水平糖尿病较模型组降低，Davidiin高剂量给药有显著作用(p<0.05)，阿卡波糖给药有非常显著的作用(p<0.01)。

表5药物治疗对大鼠糖化血红蛋白的影响(nmol/L，)

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组比较

2.5给药对大鼠血浆血糖、胰岛素的影响

给药4周后，测定各组大鼠血糖(FBG)、胰岛素(Insulin)水平，结果见表6。与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型组大鼠血浆血糖升高非常显著(p<0.01)；Davidiin给药组血浆血糖水平较糖尿病较模型组降低，并呈现剂量效应，其中Davidiin高剂量组差异显著(p<0.05)；阿卡波糖组血糖水平无显著变化。各组大鼠胰岛素水平比较，与正常对照组大鼠相比，糖尿病模型组大鼠血浆胰岛素升高非常显著(p<0.01)；给药组血浆胰岛素水平较糖尿病较模型组降低，并呈现剂量效应；阿卡波糖及Davidiin中剂量组、高剂量给药作用非常显著(p<0.01)。

表6药物治疗对大鼠空腹血糖、血浆胰岛素的影响

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组比较

2.6给药对大鼠HOMA-IR(稳态胰岛素评价指数)和HOMA-β(胰岛β细胞功能)的影响

计算各组大鼠HOMA-IR和HOMA-β，结果见表7。与正常对照组比较，糖尿病模型组的HOMA-IR升高非常显著(P<0.01)；与糖尿病模型组比较，化合物给药各组HOMA-IR均有所降低，高剂量组差异显著(P<0.05)；阿卡波糖组HOMA-IR则未表现出下降。糖尿病模型组HOMA-β较正常对照组下降非常显著(P<0.01)；各给药组与糖尿病模型组比较，无显著差异。

表7药物治疗对大鼠HOMA-IR和HOMA-β的影响

^#p<0.05，^##p<0.01，与Normal control比较；*p<0.05，**p<0.01，与Diabetic control比较

2.7给药对大鼠血浆血脂的影响

给药4周后，测定各组动物血浆血脂水平，结果见表8。与正常对照组比较，糖尿病模型组的甘油三酯(TG)及总胆固醇(TCHO)水平升高非常显著(P<0.01)；与糖尿病模型组比较，各给药治疗组甘油三酯水平均有所降低，Davidiin高剂量组与阿卡波糖组差异显著(P<0.05)；与糖尿病模型组比较，阿卡波糖组大鼠血浆总胆固醇水平无显著变化，Davidiin中剂量组、高剂量组大鼠血浆总胆固醇水平下降非常显著(P<0.01)，且Davidiin治疗呈现剂量关系。

表8药物治疗给药对糖尿病大鼠血脂的影响(mmol/L，)

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组 比较

2.8给药对大鼠血浆SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)的影响

给药4周后，测定各组动物血浆SOD、MDA水平，结果见表9。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血浆SOD水平有所下降，但无显著差异；与糖尿病模型组比较，Davidiin各剂量组、阿卡波糖组SOD水平均显著升高，差异非常显著(P<0.01)。各组大鼠血浆MDA水平比较，与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血浆MDA水平显著升高(P<0.05)；与糖尿病模型组比较，Davidiin高剂量组、阿卡波糖组MDA水平均显著下降，差异非常显著(P<0.01)。

表9药物治疗对糖尿病大鼠血浆SOD、MDA水平的影响

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组比较

2.9给药对大鼠血浆肌酐的影响

给药4周后，处死动物，测定各组动物血浆肌酐水平，结果见表10。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血浆Cr水平显著升高，差异非常显著(P<0.01)；与糖尿病模型组比较，Davidiin各剂量组Cr水平均有所下降，高剂量组差异显著(P<0.05)；阿卡波糖组Cr水平无显著变化。

表10药物治疗对大鼠血浆肌酐的影响(μmol/L，)

^#p<0.05，^##p<0.01，与正常对照组比较；*p<0.05，**p<0.01，与糖尿病模型组比较

2.10给药对大鼠胰岛组织病理的影响

正常对照组大鼠胰岛β细胞数量较多，呈条索状排列于胰岛的中心，胞质丰富，呈嗜酸性，核圆形深染；α细胞散在或成团分布于胰岛周边部，胞质较少，体积比β细胞小。糖尿病模型组大鼠胰岛胰岛萎缩，数量减少，分布稀疏，胰岛细胞发生退行性改变，数目亦减少；HE染色后观察，周围结缔组织和基膜不完整，形态不规则，胰岛β细胞数目减少，空泡增多，细胞肿胀，胞质着色浅，分布不均、边集，部分细胞核缺失，部分胞核固缩或呈残影；胰岛中心偶见β细胞出现再生，再生细胞核大，核仁突出。阿卡波糖组较糖尿病模型组胰岛轮廓比较完整，胰岛细胞数量较多，分布较规则，胞浆较饱满；Davidiin给药组较糖尿病模型组胰岛轮廓比较完整，胰岛β再生出现不同程度增多，空泡减少，胞浆较饱满，但与正常对照组比较胰岛数目较少，胰岛细胞形态欠规则。

图2药物治疗对大鼠胰岛组织病理的影响(HE，×400)

A:正常对照组大鼠(Normal control)B：糖尿病模型组(Diabetic control)

C：阿卡波糖组(Diabetic+acarbose)D：Davidiin低剂量组(Diabetic+5mg/kg*d)

E：Davidiin中剂量组(Diabetic+15mg/kg*d)F：Davidiin高剂量组(Diabetic+45mg/kg*d)

3.实验结论

上述化合物β-1,6-六羟基联苯二甲酰基-2,3,4-三没食子酸基-D-葡萄糖长期应用能够降低餐后血糖水平，改善受损葡萄糖耐量，阻滞血红蛋白蛋白的糖基化、降低胰岛素抵抗、促进胰岛细胞再生，缓解氧化应激压力，长期服用还能够改善糖脂代谢、延迟或防治肾病变的发生和发展。