苍术酮在制备治疗急性肺损伤药物中的应用的制作方法

本发明涉及中药化学及医药
技术领域：
，具体涉及从苍术(AtractylodisRhizoma)中提取制备的苍术酮(Atractylon)的医药新用途。
背景技术：
：急性肺损伤(acutelunginjury)在临床十分常见，是由各种原因所导致的肺组织结构发生特征性病理改变而出现的临床综合征，病理上以肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤、广泛性肺水肿、肺不张为主，肺内分流增加、顺应性下降，临床可表现为急性进行性、发作性呼吸困难。急性肺损伤的发病机制尚不清楚，目前认为可能由以下两个方面的原因引起：1、致病因素对肺细胞的直接损伤，例如肺部感染、肺挫伤、溺水、有毒物质吸入等；2、各种原因导致的急性全身炎症反应的间接结果，例如脓毒血症、急性胰腺炎、肺部以外的严重损伤、休克等。目前尚无治疗急性肺损伤的特效药物和手段，临床主要以支持治疗为主，积极治疗原发病，避免并发症发生，适当辅助呼吸支持治疗。由于全身和局部的炎症反应是急性肺损伤发生和发展的重要机制，临床常用糖皮质激素控制炎症反应，但大量研究显示糖皮质激素既不能预防急性肺损伤的发生，对早期治疗也没有特别的好处。因此，研究各种原因、特别是肺部感染所引起的急性肺损伤的辨治方法具有重要意义。苍术为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎，主要分布在江苏、河南、山西和陕西等地，作为许多中药方剂的组成部分，自古以来广泛应用于临床。该药具有抗病毒、抗炎、保肝和抗癌的作用，在中国古代权威的医学典籍《本草纲目》和2015版《中国药典》中，都指出其有帮助消化的作用。在民间医学中，它被用来作为一种治疗呼吸系统疾病和消化系统疾病的药物长达几个世纪之久。特别是在江苏、浙江等沿海地区，它总是与其它天然药用植物配伍(如防风、羌活)合煎后用于呼吸系统疾病。苍术属植物的化学成分主要有挥发油、苷、糖、黄酮及甾醇、营养物质等。苍术挥发油是由一系列倍半萜和聚乙烯炔类及少量酚类和倍半萜内酯等组成，倍半萜主要成分为桉叶醇，茅术醇(Hinesol)和苍术酮(Atractylon)等。倍半萜内酯作为我们日常食品所富含的一大类多酚类化合物，由于其广泛的药理活性得到很多的关注。茅苍术中提取的倍半萜内酯能够通过下调Runx2活化，抑制MMPs的表达和血管内皮细胞中VEGF的分泌，从而干扰了肿瘤的生成(Phytomedicine，2015，22:1017-1026)。苍术精油中分离的苍术醇能够抑制人类白血病HL-60细胞的生长，并通过JNK信号通路诱导细胞凋亡(JNatMed，2015，69:332-339)。苍术内酯I能够在肺癌细胞中通过线粒体介导的细胞凋亡途径发挥显著的抗肿瘤作用(Molecules，2013，18:13357-13368)。苍术内酯III可以在RBL-2H3细胞中显著抑制IgE/Ag介导的细胞脱颗粒作用，而不影响细胞活力(ImmunopharmacolImmunotoxicol，2015，15:1-5]；其抗过敏活性依赖于对Akt、p38和JNK激酶磷酸化的抑制作用，以及IgE/Ag介导的[Ca2+]i的升高(JEthnopharmacol，2013，145:278-285)。然而，苍术提取物及其活性成分对急性肺损伤的作用和机制，尚未见到相关报道。本发明通过相关实验，研究了苍术提取物及其活性成分苍术酮（Atractylon，其化学结构式见（I））的保护作用。(I)目前尚无治疗急性肺损伤的特效药物和手段，临床常用糖皮质激素控制炎症反应，但大量研究显示其既不能预防急性肺损伤的发生，对早期治疗也没有特别的好处。因此，研发新的治疗急性肺损伤的药物和手段十分重要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题，是提出苍术酮的新医药用途，即在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。本发明从苍术中提取分离得到足够量的苍术酮(结构式（I）)，通过药理实验，证实下述结构式（I）表示的苍术酮能够用于治疗急性肺损伤。(I)本发明所述苍术酮的提取分离采用超临界二氧化碳萃取和硅胶柱色谱法，主要包括如下步骤：(1)前处理步骤：将待提取的苍术饮片去除杂质后粉碎成粉末；(2)提取步骤：采用HA121的超临界液体萃取仪(华安仪器厂，江苏，中国)进行超临界二氧化碳萃取。取苍术饮片100g粉碎成粉末，置于萃取釜内，在350bar压力、温度50℃动态提取时间持续60min，乙醇(99.9%)作为改性剂，流速为5ml/min。超临界二氧化碳流速设定为15g/min，静态萃取时间设定为30min。去除溶剂，得到的产物为5.8%。用于体外研究的超临界二氧化碳萃取物溶于磷酸盐缓冲液，浓度为1mg/ml。(3)纯化步骤：将超临界CO2萃取物(50g)用于硅胶柱，使用石油醚(沸点60~90℃)和乙酸乙酯(30:1→1:1，V/V)进行分离。首先制备色谱柱：称取硅胶40克，将硅胶与洗脱剂按比例混合(20:1)，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，不能留有气泡，然后加入石油醚将附着在管壁的硅胶洗下，使色谱柱面平整，平衡1小时后加入供试品进行洗脱。将萃取物溶于石油醚中，沿着色谱柱管壁缓慢加入，当液面下降至与柱表面相平时，即从色谱柱顶端缓慢加入洗脱剂石油醚。将洗脱剂石油醚沿管壁缓慢加入，打开底阀，缓慢滴加，控制流速为lmL/min，当流过色谱柱的一个空体积后即用标号的试剂瓶开始收集。得到化合物4(6毫克)，化合物3(2毫克)，化合物5(50毫克)，化合物6(4毫克)，化合物1(10毫克)和化合物2(13毫克)。采用紫外光谱、质谱分析、1H和13C核磁共振光谱鉴定，上述化合物分别为苍术内酯I(10毫克)，苍术内酯III(13毫克)，苍术醇(2毫克)、α-姜黄烯(6毫克)，苍术酮(50毫克)、苍术呋喃烃(4毫克)。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明提供下述结构式(I)表示的苍术酮在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。(I)优选的，所述苍术酮具有抑制小鼠急性肺损伤的功能。优选的，所述苍术酮具有保护急性肺损伤小鼠死亡的功能。优选的，所述苍术酮具有对急性肺损伤小鼠肺组织TLR7信号通路的调控功能。优选的，所述治疗急性肺损伤药物含有药学上有效量的苍术酮以及药学上可接受的载体。按本领域常用的制药工艺，所述药物可以被制成任何一种药学上可接受的剂型。优选的，所述任何一种药学上可接受的剂型包括混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂等。本发明经药理实验验证，苍术酮能够降低急性肺损伤小鼠的死亡率，延长小鼠平均生存时间；能够显著抑制急性肺损伤小鼠的肺指数，HE染色显示与模型组相比较，治疗组肺组织肺泡明显，细胞相对较完整，炎性介质渗出减少，肺细胞间隔增厚较轻，细支气管上皮柱状细胞脱落减少；说明苍术酮治疗后显示肺组织学损伤得到了明显改善，这些作用呈现剂量依赖性。对血清中干扰素-α、IL-1β、IL-6和TNF-α水平检测发现，苍术酮显著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性细胞因子的水平(IL-6、TNF-α和IL-1β)。基因检测结果发现TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表达显著上调，这表明上述信号途径被激活。Westernblot分析结果显示，苍术酮治疗后，TLR7下游因子中最重要的炎症蛋白NF-κBp65蛋白表达明显增加。综合这些结果表明，苍术酮在治疗急性肺损伤中的作用，依赖于TLR7信号通路的激活，诱导I型干扰素的生产和NF-κBp65的抑制。从本发明药理及活性实验结果来看，苍术酮能够明显减轻急性肺损伤小鼠的肺部炎症，减少动物的死亡；其作用与其激活TLR7诱导I型干扰素的生成、抑制NF-κB的激活密切相关。这些结果表明，苍术酮可用于制备治疗急性肺损伤的有效药物，具有良好的应用前景和应用价值。附图说明图1是本发明试验例4中苍术酮对小鼠急性肺损伤的作用示意图。图2是本发明试验例5中苍术酮对急性肺损伤小鼠肺组织TLR7信号通路的调节作用示意图，其中图2(A)表示RFQ-PCR检测TLR7、MyD88、TRAF6和IFN-βmRNA表达水平；图2(B)表示Westernblot检测NF-κBp65蛋白表达水平。其中，NC表示正常对照组，MC表示模型对照组，Ribabirin表示利巴韦林，Atractylon10表示苍术酮10mg/kg治疗组，Atractylon20表示苍术酮20mg/kg治疗组，Atractylon40表示苍术酮40mg/kg治疗组。检测值采用内参照(18SrRNA或者β-actin)进行校正。与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01。具体实施方式以下实施例及试验例中采用的试药、抗体、耗材、试剂盒及动物说明如下：1、试药、抗体、耗材和试剂盒中药苍术购自华东药业公司(上海)，由浙江中医药大学鉴定。标本(编号y20141022)存放在浙江医学院药学系。HA121超临界液体萃取仪为江苏华安仪器厂产品。血清IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附检测试剂盒购自Biovol技术公司。Trizol裂解和提取试剂盒购自上海Biotechnology公司。cDNA合成试剂盒购自大连Takara公司。BCA试剂盒购自碧云天生物公司。NF-κBp65抗体和β-actin抗体购自康成生物。OdysseyIRDye680conjugated山羊抗兔IgG、OdysseyBlockingBuffer均产自美国Li-Cor公司。NonidetP40产于美国SIGMA-ALDRICH公司，PMSF购自美国Fluka公司。完全性蛋白酶抑制剂混合物为德国Roche公司产品；40%Acrylamide/bisSolution[N，N’-Methylenbis-acrylamid，Mix，Ratio37.5:1(2.6%C)]和Tween-20购自美国Bio-Rad公司。预染蛋白标准品产于加拿大Fermentas公司。硝酸纤维薄膜、甘氨酸、Tris、TEMED、EDTA、SDS为美国Amresco产品。异丙醇、溴酚蓝购自上海试剂三厂。过硫酸铵、甲醇、浓盐酸均为分析纯，购自中国国药集团化学试剂有限公司。Odyssey红外扫描系统为Li-Cor公司产品。2、动物雄性SPF级ICR小鼠，体重(22±2)g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(浙)2014-0001。实施例1、超临界二氧化碳萃取和硅胶柱色谱法分离苍术酮采用HA121的超临界液体萃取仪(华安仪器厂，江苏，中国)进行超临界二氧化碳萃取。取苍术饮片100g粉碎成粉末，置于萃取釜内，在350bar压力、温度50℃动态提取时间持续60min，乙醇(99.9%)作为改性剂，流速为5ml/min。超临界二氧化碳流速设定为15g/min，静态萃取时间设定为30min。去除溶剂，得到的产物为5.8%。用于体外研究的超临界二氧化碳萃取物溶于磷酸盐缓冲液，浓度为1mg/ml。将超临界CO2萃取物(50g)用于硅胶柱，使用石油醚(沸点60~90℃)和乙酸乙酯(30:1→1:1，V/V)进行分离。首先制备色谱柱：称取硅胶40克，将硅胶与洗脱剂按比例混合(20:1)，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，不能留有气泡，然后加入石油醚将附着在管壁的硅胶洗下，使色谱柱面平整，平衡1小时后加入供试品进行洗脱。将萃取物溶于石油醚中，沿着色谱柱管壁缓慢加入，当液面下降至与柱表面相平时，即从色谱柱顶端缓慢加入洗脱剂石油醚。将洗脱剂石油醚沿管壁缓慢加入，打开底阀，缓慢滴加，控制流速为lmL/min，当流过色谱柱的一个空体积后即用标号的试剂瓶开始收集。得到化合物4(6毫克)，化合物3(2毫克)，化合物5(50毫克)，化合物6(4毫克)，化合物1(10毫克)和化合物2(13毫克)。采用紫外光谱、质谱分析、1H和13C核磁共振光谱鉴定，上述化合物分别为苍术内酯I(10毫克)，苍术内酯III(13毫克)，苍术醇(2毫克)、α-姜黄烯(6毫克)，苍术酮(50毫克)、苍术呋喃烃(4毫克)。实施例2、苍术酮片剂的制备成分每片用量苍术酮50mg糊精37.45mg微晶纤维素10.5mg淀粉17.5mg乳糖10.5mg硬脂酸镁1.05mg按处方量将苍术酮(按实施例1方法制得)加入糊精、微晶纤维素、淀粉、乳糖混匀，制成颗粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片，即得(每片含苍术酮0.05g)。成人推荐口服用量1-4片/次，每日2~3次。实施例3、苍术酮胶囊的制备成分每粒用量苍术酮50mg糊精37.45mg微晶纤维素10.5mg淀粉17.5mg乳糖10.5mg按处方量将苍术酮(按实施例1方法制得)糊精、微晶纤维素、淀粉、乳糖混匀，制成颗粒后，填装入0号硬胶囊壳，打光即制得(每粒胶囊含苍术酮0.05g)。成人推荐口服用量1-4粒/次，每日2~3次。下面通过试验例以苍术酮的药理和活性实验及结果来进一步说明本发明。试验例1、苍术酮对小鼠急性肺损伤的抑制作用雄性ICR小鼠，分为正常对照组、急性肺损伤模型组，利巴韦林疗组和药物治疗组(每组24只)。在造模2小时后，试验组中苍术酮或利巴韦林采用灌胃给药，每日1次共5天。模型对照组小鼠，在相同的时间间隔给予生理盐水。每日观察所有小鼠的体重变化和存活情况。实验结束后每组10只小鼠处死，用于计算肺指数。实验结果见表1。表1、苍术酮对小鼠急性肺损伤的抑制作用组别剂量(mg/kg)数量(n)肺指数(mg/g)抑制率(%)正常组-107.35±0.51**-模型组-1021.26±4.75-利巴韦林组501012.68±3.30**61.7苍术酮组401010.90±3.76**74.5苍术酮组201013.08±4.54**58.8苍术酮组101017.43±4.16*27.5与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01。如表1所示，苍术酮组对小鼠急性肺损伤有一定的抑制率，证明苍术酮对小鼠急性肺损伤有明显的抑制作用。试验例2、苍术酮对急性肺损伤小鼠死亡的保护作用雄性ICR小鼠，分为正常对照组、急性肺损伤模型组，利巴韦林疗组和药物治疗组(每组20只)。在造模2小时后，试验组中苍术酮或利巴韦林采用灌胃给药，每日1次共5天。模型对照组小鼠，在相同的时间间隔给予生理盐水。每日观察所有小鼠的存活情况。共观察14天。实验结果见表2。表2、苍术酮对急性肺损伤小鼠死亡的保护作用组别剂量(mg/kg)存活数/总数生存率(%)MDD±S.D.寿命延长率(%)正常组-20/20100.014.0±0.0**-模型组-3/2015.07.9±2.8-利巴韦林组5010/2050.011.1±3.1**40.5苍术酮组4014/2070.012.4±2.6**57.0苍术酮组2011/2055.011.2±3.3**41.8苍术酮组106/2030.09.3±3.6**17.7MDD，感染到死亡的平均天数。与模型相比较**P<0.01。如表2所示，苍术酮组能够降低急性肺损伤小鼠的死亡率，延长小鼠平均生存时间；证明苍术酮对急性肺损伤小鼠死亡有明显的保护作用。试验例3、苍术酮对急性肺损伤小鼠血清IFN-β、IL-6、TNF-α和IL-1β的影响雄性ICR小鼠，分为正常对照组、模型组，利巴韦林疗组和药物治疗组(每组24只)。在感染2小时后，试验组中苍术酮或利巴韦林采用灌胃给药，每日1次共5天。经过5天的治疗，测定动物体重后处死动物。采集血标本，离心3000×g共20分钟分离血清，储存于4℃待检。血清IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。实验结果见表3。表3、苍术酮对急性肺损伤小鼠血清细胞因子的影响与模型组相比较，*P<0.05，**P<0.01。如表3所示，苍术酮组显著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性细胞因子的水平(IL-6、TNF-α和IL-1β)。试验例4、苍术酮对急性肺损伤小鼠肺组织病理的影响实验结束处死动物后，将小鼠的全肺切除。每个肺的一部分被解剖和固定在10%中性福尔马林缓冲溶液中。其余肺组织快速冷冻保存在-80℃用于生化检测。固定组织常规处理，石蜡包埋，切成4μm切片，根据标准流程进行脱蜡和水化。所有的组织切片进行HE染色，结果见图1。如图1所示，HE染色显示与模型对照组相比较，苍术酮治疗组肺组织肺泡明显，细胞相对较完整，炎性介质渗出减少，肺细胞间隔增厚较轻，细支气管上皮柱状细胞脱落减少；说明苍术酮治疗后显示肺组织学损伤得到了明显改善，这些作用呈现剂量依赖性。试验例5、苍术酮对急性肺损伤小鼠肺组织TLR7信号通路的调控小鼠肺组织采用Trizol试剂进行匀浆和提取总RNA(BiotechnologyCo.，Ltd.，上海，中国)。根据试剂盒提供的操作说明，合成cDNA(Takara公司，大连，中国)。本研究使用的特异性引物(TLR-7、MyD88、TRAF6、IFN-β和18sRNA)见表4。这些引物由上海生工公司(中国)合成。选择真核细胞的18SrRNA作为研究对象的看家基因。扩增反应体系含有2μLcDNA、0.5μL正向和反向引物(终浓度每0.5μM)、12.5μL2×SYBRGreen，无核酸酶的水，反应体积为25μL。扩增反应的条件为：95℃1分钟，然后40个循环，95℃变性10s，55℃退火25s，64℃延长25s，然后64℃延长25s采集荧光数据。使用2-ΔCt×106方法计算基因的相对表达水平。Westernblot检测采用RIPA试剂分离肺组织总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶中蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，加Odysseyblockingbuffer封闭，加入1抗(NF-κBp65，工作浓度1:1000)，4℃下摇床振荡过夜，洗涤后加入2抗反应。洗涤后将膜置于Odyssey仪器上扫描、分析，使用内参照β-actin校正目标蛋白表达量。试验结果见图2，如图2（A）所示的基因检测结果发现TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表达显著上调，这表明上述信号途径被激活。如图2（B）所示的Westernblot分析结果显示，苍术酮治疗后，TLR7下游因子中最重要的炎症蛋白NF-κBp65蛋白表达明显增加(P<0.01)。表4、RFQ-PCR检测引物序列从本发明研究发现，苍术酮治疗能够降低急性肺损伤小鼠的死亡率，延长小鼠平均生存时间；能够显著抑制急性肺损伤小鼠的肺指数，HE染色显示与模型组相比较，治疗组肺组织肺泡明显，细胞相对较完整，炎性介质渗出减少，肺细胞间隔增厚较轻，细支气管上皮柱状细胞脱落减少；说明苍术酮治疗后显示肺组织学损伤得到了明显改善，这些作用呈现剂量依赖性。对血清中干扰素-α、IL-1β、IL-6和TNF-α水平检测发现，苍术酮显著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性细胞因子的水平(IL-6、TNF-α和IL-1β)。基因检测结果发现TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表达显著上调，这表明上述信号途径被激活。Westernblot分析结果显示，苍术酮治疗后，TLR7下游因子中最重要的炎症蛋白NF-κBp65蛋白表达明显增加(P<0.01)。综合这些结果表明，苍术酮在治疗急性肺损伤中的作用，依赖于TLR7信号通路的激活，诱导I型干扰素的生产和NF-κBp65的抑制。从本发明药理及活性实验结果来看，苍术酮能够明显减轻了急性肺损伤小鼠的肺部炎症，减少动物的死亡；其作用与其激活TLR7诱导I型干扰素的生成、抑制NF-κB的激活密切相关。这些结果表明，苍术酮可用于制备治疗急性肺损伤的有效药物，具有良好的应用前景和应用价值。当前第1页1 2 3