本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种吩嗪-1-羧酸作为水母毒素蛋白酶抑制剂的用途。
背景技术：
近年来，水母数量激增，水母蜇伤事件频繁发生，严重影响海滨旅游、海洋捕捞、海军训练及海上运动项目等涉海活动。水母蜇伤已成为最常见的海洋生物蜇伤，据美国国立卫生院估计，全球每年有1.5亿人被水母蜇伤，其中不乏死亡病例。水母属于刺胞动物，刺细胞是刺胞动物特有的攻击防卫性细胞。当水母触及人体时，从刺胞中伸出刺丝，即刻刺入皮肤并注入毒液引起皮肤反应。被水母蜇伤后，即感到刺痒、麻痛或灼烧感，以后局部发生红斑、丘疹或荨麻疹样皮疹，奇痒无比，影响日常生活，特别是睡眠。
水母毒素是蜇伤的物质基础，成分复杂，主要为蛋白和肽类毒素，具有多种生物活性，如溶血性、酶活性、神经毒活性、细胞毒活性以及对心血管系统的活性等。复杂的毒素成分和蜇伤机理导致水母蜇伤治疗非常困难。随着水母毒素研究的深入，水母毒素中的酶类成分，如金属蛋白酶、磷脂酶，吸引了越来越多的关注。由于酶类毒素在已知的生物毒素中占相当比例，如蛇毒中酶类毒素的数量占已知的蛇毒总量的23％，并且在蛇毒咬伤引发的生理病理性症状中起重要作用。因此，水母毒素中存在的酶类毒素也可能是理解水母蜇伤的关键。
吩嗪-1-羧酸可抑制多种农业病原真菌，主要作为抗菌剂应用。我们在实验中发现，吩嗪-1-羧酸可以有效抑制水母毒素中的重要酶类成分。这一发现，不仅拓宽了吩嗪-1-羧酸的应用范围，也为筛选抗水母毒素的小分子化合物提供参考，同时为研制水母蜇伤药物奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供吩嗪-1-羧酸作为水母毒素蛋白酶抑制剂的用途。
本发明实现目的的方案如下：
吩嗪-1-羧酸作为水母毒素蛋白酶抑制剂的用途，所述吩嗪-1-羧酸的结构式如式Ⅰ所示。
优选的，所述抑制剂配制方法：将吩嗪-1-羧酸用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再用50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液稀释制得。
吩嗪-1-羧酸抑制水母毒素蛋白酶活性的实验方法为：吩嗪-1-羧酸用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再用50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液稀释得到吩嗪-1-羧酸溶液。然后向水母毒素中加入吩嗪-1-羧酸溶液，使吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比大于或等于0.70:1，37℃条件预处理60min后，向以上混合物中加入底物偶氮酪蛋白(azocasein)启动反应。将以上反应混合物置于37℃下反应90min，反应完成后，室温下加5％三氯乙酸(w/w)。静置30min后15000g离心15min，取150μL上清液加入到96孔板中，然后加150μL 0.5M NaOH中和多余三氯乙酸后，用酶标仪测量A450nm，根据以下公式计算抑制率。
本发明的优点：
1)、本发明利用吩嗪-1-羧酸抑制水母毒素蛋白酶活性，指出吩嗪-1-羧酸可作为蛋白酶抑制剂使用，扩展了吩嗪-1-羧酸的应用范围。
2)、本发明为筛选抗水母毒素的小分子化合物提供理论参考，也为水母蜇伤药物的研制奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例中吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)在不同质量比条件下，吩嗪-1-羧酸抑制水母毒素蛋白酶活力图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
吩嗪-1-羧酸溶液配制方法：取1.25g吩嗪-1-羧酸，用DMSO溶解，再用50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液稀释定容至100mL，制得12.5mg/mL吩嗪-1-羧酸溶液；然后将12.5mg/mL吩嗪-1-羧酸溶液用50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液稀释，分别配置浓度为2.78mg/mL、5.55mg/mL、11.1mg/mL的吩嗪-1-羧酸溶液。
2mg/mL水母毒素溶液配制方法：冰冻的水母触手组织从-80℃冰箱中取出后，置于4℃冷藏柜中解冻、自溶2-4天。期间为加速水母触手溶解，每隔一天小心倾倒上层海水后加入新鲜海水，加速刺丝囊细胞从触手上脱落。待水母组织完全自溶后，缓慢倒掉上层自溶液，收集下层带有沉淀的自溶液，然后分别用60目和100目的分样筛过滤。收集过滤液，3000g离心15min，收集下层沉淀，再用干净海水洗2-3次并离心，即得到较为纯净的刺丝囊。将刺丝囊细胞置于-80℃冰箱中保存，备用。取3g刺丝囊，然后加入9mL在4℃中预冷的20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)进行提取。采用超声破碎提取，提取条件设定为：400W，90个循环。每一个循环包含15s破碎，10s间歇。破碎完成后4℃、15000g冷冻离心30min，上清液即为以蛋白计浓度为2mg/mL的水母毒素溶液。水母毒素的测定采用福林酚法(张蕾,刘昱,蒋达和,杨明园,曹志贱.生物化学实验指导[M].武汉：武汉大学出版社,2011.95～98.)，以牛血清白蛋白(BSA)为标准。
5mg/mL azocasein溶液配置方法：称取50.0mg azocasein置于50mL烧杯中，加入10mL实验缓冲液，所述实验缓冲液为含100mM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液，轻轻搅拌使其溶解，得最终浓度为5mg/mL的azocasein溶液。
实施例1：
取5μL吩嗪-1-羧酸溶液(2.78mg/mL)或5μL 50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液(空白对照)与10μL水母毒素(2.0mg/mL)在37℃条件下预处理60min，充分混匀，吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.70:1，然后向以上混合物中加入85μL 5mg/mL azocasein溶液启动反应。将以上反应混合物置于37℃下反应90min，反应完成后，室温下加200μL5％三氯乙酸(w/w)。静置30min后15000g离心15min，取150μL上清液加入到96孔板中，然后加150μL 0.5M NaOH中和多余三氯乙酸后，用酶标仪测量A450nm，反应设置四个平行，根据以下公式计算抑制率。
实验结果显示，当吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比为0.70:1时，吩嗪-1-羧酸对水母毒素蛋白酶活力的抑制率分别为6.3％，8.2％，2.9％和8.8％，平均值为6.6％±2.6％。
实施例2：
取5μL吩嗪-1-羧酸溶液(5.55mg/mL)或5μL 50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液(空白对照)与10μL水母毒素(2.0mg/mL)在37℃条件下预处理60min，充分混匀，吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比为1.39:1，然后向以上混合物中加入85μL 5mg/mL azocasein溶液启动反应。将以上反应混合物置于37℃下反应90min，反应完成后，室温下加200μL5％三氯乙酸(w/w)。静置30min后15000g离心15min，取150μL上清液加入到96孔板中，然后加150μL 0.5M NaOH中和多余三氯乙酸后，用酶标仪测量A450nm，反应设置四个平行，根据以下公式计算抑制率。
实验结果显示，当吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量为1.39:1时，吩嗪-1-羧酸对水母毒素蛋白酶活力的抑制率分别为3.5％，3.8％，9.4％和9.1％，平均值为6.5％±3.2％。
实施例3：
取5μL吩嗪-1-羧酸溶液(11.1mg/mL)或5μL 50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液(空白对照)与10μL水母毒素(2.0mg/mL)在37℃条件下预处理60min，充分混匀，吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比为2.78:1，然后向以上混合物中加入85μL 5mg/mL azocasein溶液启动反应。将以上反应混合物置于37℃下反应90min，反应完成后，室温下加200μL 5％三氯乙酸(w/w)。静置30min后15000g离心15min，取150μL上清液加入到96孔板中，然后加150μL 0.5M NaOH中和多余三氯乙酸后，用酶标仪测量A450nm，反应设置四个平行，根据以下公式计算抑制率。
实验结果显示，当吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的比例为2.78:1时，吩嗪-1-羧酸对水母毒素蛋白酶活力的抑制率分别为65.2％，59.6％，55.3％，64.5％，平均值为61.2％±4.6％。
实施例4：
取10μL吩嗪-1-羧酸溶液(11.1mg/mL)或10μL 50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液(空白对照)与10μL水母毒素(2.0mg/mL)在37℃条件下预处理60min，充分混匀，吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比为5.55:1，然后向以上混合物中加入85μL 5mg/mL azocasein溶液启动反应。将以上反应混合物置于37℃下反应90min，反应完成后，室温下加200μL5％三氯乙酸(w/w)。静置30min后15000g离心15min，取150μL上清液加入到96孔板中，然后加150μL 0.5M NaOH中和多余三氯乙酸后，用酶标仪测量A450nm，反应设置四个平行，根据以下公式计算抑制率。
实验结果显示，当吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的比例为5.55:1时，吩嗪-1-羧酸对水母毒素蛋白酶活力的抑制率分别为71.1％，75.1％，79.2％，79.2％，平均值为76.2％±3.9％。
实施例5：
取10μL吩嗪-1-羧酸溶液(12.5mg/mL)或10μL 50mM Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液(空白对照)与10μL水母毒素(2.0mg/mL)在37℃条件下预处理60min，充分混匀，吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的质量比为6.25:1，然后向以上混合物中加入85μL 5mg/mL azocasein溶液启动反应。将以上反应混合物置于37℃下反应90min，反应完成后，室温下加200μL5％三氯乙酸(w/w)。静置30min后15000g离心15min，取150μL上清液加入到96孔板中，然后加150μL 0.5M NaOH中和多余三氯乙酸后，用酶标仪测量A450nm，反应设置五个平行，根据以下公式计算抑制率。
实验结果显示，当吩嗪-1-羧酸与水母毒素(以蛋白计)的比例为6.25:1时，吩嗪-1-羧酸对水母毒素蛋白酶活力的抑制率分别为85.2％，85.5％，85.2％，85.5％和80.5％，平均值为84.4％±2.2％。