环氧化酶‑2及其抑制剂在膀胱癌中的应用的制作方法

本发明属于医药，涉及膀胱癌治疗靶点的发现和治疗药物的开发，具体涉及环氧化酶-2及其抑制剂在膀胱癌中的应用。

背景技术：

膀胱癌是泌尿系统常见恶性肿瘤，以移行上皮细胞癌为多。据世界卫生组织2002年统计，全球每年约有36万新发病例，发病率居恶性肿瘤第九位，男性患者约占75％～80％，平均发病年龄为70岁；每年约有15万人死于膀胱癌，在致命癌症中排第12位，在非治疗情况下，自然生存期约16至20个月。临床上，间歇出现无痛性血尿是膀胱癌的最早症状，分化良好的乳头状肿瘤可有严重血尿，分化不良的浸润性癌却反而血尿不严重，非上皮性肿瘤血尿也较轻。尿频、尿急等膀胱刺激症状，提示膀胱原位癌的可能。但若非同时伴有感染或肿瘤位于膀胱三角区，其他早期膀胱癌较少出现尿路刺激症状。当肿瘤较大或阻塞膀胱口时，可出现排尿困难或尿潴留。晚期甚至可累及下腹部浸润性肿瘤，或出现严重贫血和浮肿等。

环氧化酶(Cox)是花生四烯酸代谢过程中前列腺素合成的限速酶，有Cox-1和Cox-2两种同工酶。Cox-1是一种结构型酶，属人体正常成分，可在大多数组织中均有表达；而Cox-2则是一种诱导型酶，其基因长约8.8kb，含有10个外显子和9个内含子，正常生理状态时Cox-2在绝大多数组织都不表达，但在受到如生长因子、细胞因子、促癌剂等刺激时则会迅速合成，激活炎症反应，而长期的慢性炎症可促进肿瘤发生发展。在许多实体肿瘤如宫颈癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等中，均有Cox-2的表达上调，而应用cox抑制剂可起到一定的抑制效果。cox抑制剂，又称非甾体类抗炎药，是全球使用最多的药物之一，其主要通过抑制cox的表达，减少炎性介质前列腺素的生成，产生抗炎、镇痛、解热的作用。

2-胺基苯并恶唑及其衍生物是典型的杂环化合物，活性多样，但目前尚未发现其对环氧化酶-2和膀胱癌的作用报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于环氧化酶-2及其抑制剂在膀胱癌中的应用。

本发明上述目的是通过以下技术方案得以实现：

环氧化酶-2及其抑制剂在制备治疗膀胱癌的药物中的应用。

优选地，所述抑制剂为2-胺基苯并恶唑衍生物。

优选地，所述2-胺基苯并恶唑衍生物为如下衍生物1-4中的一种：

衍生物1

衍生物2

衍生物3

衍生物4

药物组合物在制备治疗膀胱癌的药物中的应用，所述药物组合物含有上述抑制剂和药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。

优选地，所述药学上可以接受的载体包括一种或多种固体、半固体或液体辅料；药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液体制剂。

本发明的有益效果：

本发明发现环氧化酶-2的选择性抑制剂尼美舒利可以通过下调环氧化酶-2的表达抑制膀胱癌细胞T24的增殖；并用该模型筛选得到四个环氧化酶-2的抑制剂，这四个抑制剂化合物均为2-胺基苯并恶唑衍生物，均可以下调环氧化酶-2的表达，抑制T24的增殖。本发明证实环氧化酶-2可以作为药物靶标筛选抑制膀胱癌的药物。

附图说明

图1为四种2-胺基苯并恶唑衍生物1-4的化学结构式；

图2为不同浓度衍生物1-4作用于T24细胞48小时后对T24细胞的抑制率(2B)及T24细胞中COX-2蛋白Western Blot测定结果(2A)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。

实施例1：尼美舒利对膀胱癌细胞环氧化酶-2表达和细胞增殖的影响

一、实验材料

膀胱癌细胞系T24为本公司长期保存；甲基塞唑蓝MTT、二甲基亚砜DMSO、DMEM培养基和胎牛血清购自Sigma公司。其他为常规试剂。

二、实验方法

1、细胞培养和实验分组

膀胱癌细胞系T24按常规方法培养。含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养，48h换液1次。取对数生长期细胞进行试验。实验分为对照组和尼美舒利组，对照组不添加环氧化酶-2抑制剂，尼美舒利组添加尼美舒利处理。具体如下：

将对数期的膀胱癌细胞系T24按照2×10⁴/孔细胞接种于96孔培养板中，培养24h后，尼美舒利组T24细胞中加入终浓度为50、100和200μmol/L的尼美舒利，培养48h。

2、细胞中环氧化酶-2(COX-2)的表达测定(Western Blot法)

取尼美舒利作用48h的细胞，裂解细胞后提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，每组各取50μg蛋白上样，SDS-PAGE蛋白电泳并将蛋白转至PVDF膜上。一抗为兔抗人COX-2多克隆抗体，稀释度为1:1000，多克隆小鼠抗β-actin抗体，稀释度为1:2000，4℃环境下孵育过夜。次日分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，稀释度均为1:5000，室温孵育1h。经洗涤后，通过ECL化学发光试剂显影，压片曝光后将胶片进行拍照，用凝胶图像处理系统测定各条带的光密度值，以COX-2/β-actin的比值作为COX-2蛋白的相对表达量。

3、细胞增殖抑制率测定

培养48h后，测定各孔的吸光度(A)，测定前每孔加5mg/ml的MTT 20μl，温育4h，弃上清液后，加入DMSO 200μl/孔。用酶标仪在波长560nm下检测。用各组的平均A值计算出细胞增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(1-尼美舒利组A/对照组A)×100％。

三、实验结果

1、尼美舒利对膀胱癌细胞系T24形态学影响

与对照组相比，尼美舒利组细胞形态出现异常，胞体变圆和不规则、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢。随着时间增长，部分细胞从培养板壁脱落。

2、尼美舒利对膀胱癌细胞系T24中环氧化酶-2表达的影响

Western Blot结果显示，在内参β-actin蛋白条带灰度基本一致的情况下，与对照组相比，尼美舒利组COX-2蛋白的相对表达量显著下调，结果见表1。

表1培养48h后各组COX-2蛋白的相对表达量

3、尼美舒利对膀胱癌细胞系T24增殖抑制率的影响

MTT法检测结果显示尼美舒利对T24细胞的生长具有明显的抑制作用，且抑制作用与药物浓度呈明显的依赖关系，结果见表2。

表2培养48h后各组T24细胞的增殖抑制率

实施例1结果表明，环氧化酶-2可能是尼美舒利抑制T24细胞增殖的靶标，尼美舒利通过抑制环氧化酶-2的表达发挥对膀胱癌细胞系T24的增殖抑制作用。

实施例2：环氧化酶-2抑制剂的筛选

一、实验材料

膀胱癌细胞系T24为本公司长期保存；甲基塞唑蓝MTT、二甲基亚砜DMSO、DMEM培养基和胎牛血清购自Sigma公司。其他为常规试剂。

二、实验方法

1、细胞培养和实验分组

膀胱癌细胞系T24按常规方法培养。含10％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5％CO₂及饱和湿度下培养，48h换液1次。取对数生长期细胞进行试验。实验分为对照组和给药组，对照组不添加环氧化酶-2抑制剂，给药组添加不同待测化合物处理。具体如下：

将对数期的膀胱癌细胞系T24按照2×10⁴/孔细胞接种于96孔培养板中，培养24h后，给药组T24细胞中加入不同终浓度的待测化合物，培养48h。待测化合物结构如表3和图1。

表3待测化合物结构

2、细胞增殖抑制率测定，计算IC50(抑制率为50％时化合物浓度)

培养48h后，测定各孔的吸光度(A)，测定前每孔加5mg/ml的MTT 20μl，温育4h，弃上清液后，加入DMSO 200μl/孔。用酶标仪在波长560nm下检测。用各组的平均A值计算出细胞增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(1-给药组A/对照组A)×100％。

3、细胞中环氧化酶-2(COX-2)的表达测定(Western Blot法)

取待测化合物作用48h的细胞，裂解细胞后提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，每组各取50μg蛋白上样，SDS-PAGE蛋白电泳并将蛋白转至PVDF膜上。一抗为兔抗人COX-2多克隆抗体，稀释度为1:1000，多克隆小鼠抗β-actin抗体，稀释度为1:2000，4℃环境下孵育过夜。次日分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，稀释度均为1:5000，室温孵育1h。经洗涤后，通过ECL化学发光试剂显影，压片曝光后将胶片进行拍照，用凝胶图像处理系统测定各条带的光密度值，以COX-2/β-actin的比值作为COX-2蛋白的相对表达量。

三、实验结果

1、不同化合物对T24细胞的增殖抑制率和IC50值

MTT法检测结果显示各化合物对T24细胞的生长具有明显的抑制作用，且抑制作用与药物浓度呈明显的依赖关系，IC50值见表4。

表4 2-胺基苯并恶唑衍生物IC50值(μmol/L，作用时间为48h)

发明人还测试了衍生物1-4对人正常膀胱上皮细胞(SV-HUC-1细胞系，作用时间为24h)的毒性，衍生物1-3的细胞毒性相对较高，120μmol/L即出现明显的细胞毒作用(与对照组相比抑制率≥20％，下同)，衍生物4在400μmol/L时抑制率仍＜10％。衍生物1-3可以开发成膀胱癌靶向药物，以降低对正常细胞的损伤。

2、不同化合物对T24细胞中环氧化酶-2表达的影响

Western Blot结果显示，在内参β-actin蛋白条带灰度基本一致的情况下，与对照组相比，给药组COX-2蛋白的相对表达量均显著下调，且下调程度与给药剂量呈依赖关系。不同浓度衍生物1-4(见表5)作用于T24细胞48小时后对T24细胞的抑制率及T24细胞中COX-2蛋白Western Blot测定结果如图2所示。

表5衍生物1-4测试浓度水平(μmol/L)

本发明发现环氧化酶-2的选择性抑制剂尼美舒利可以通过下调环氧化酶-2的表达抑制膀胱癌细胞T24的增殖；并用该模型筛选得到四个环氧化酶-2的抑制剂，这四个抑制剂化合物均为2-胺基苯并恶唑衍生物，均可以下调环氧化酶-2的表达，抑制T24的增殖。本发明证实环氧化酶-2可以作为药物靶标筛选抑制膀胱癌的药物。