乌梅总多酚的提取方法与流程

本发明涉及乌梅果实或叶中总多酚的提取方法，还涉及总多酚提取物的制备方法以及乌梅中总多酚的含量检测方法。

背景技术：

乌梅是蔷薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果实，可通过熏制或烘至加工而成。又名梅实，始载于《神农本草经》列为中品，历代本草中均划属收涩药。乌梅性平,味酸涩,归肝、脾、肺、大肠经，用于肺虚久咳、清热消渴、驱虫止痢、呕吐腹痛、久痢滑肠、口干烦渴等。在现代医学上还用于治疗偏头痛、结核、病毒性肝炎、肿瘤、白癜风等。梅资源丰富，应用广泛，主产于四川、福建、贵州等地，而四川的产量较大。

多酚类化合物是植物代谢产物之一，在植物界中含有该类化合物的种类多达6500种以上，这些都是植物代谢过程中生成的代谢产物。多酚是广泛存在于植物体内的多元酚化合物，多酚类物质存在于许多水果、蔬菜中，是人们每天从食物中摄取数量最多的抗氧化物质。多酚类化合物不仅是一种天然的抗氧化剂，还具有保护DNA抗突变、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、降血压、降血糖等药理活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供毛莲蒿中香豆素类化合物的提取方法。

具体地，本发明提供了乌梅果实或叶中总多酚成分的提取方法，它包括如下操作步骤：

(1)取乌梅果实或叶，粉碎后，备用；

(2)以55-65％v/v乙醇为溶剂进行超声提取，料液比1：35-45g.ml^-1，提取时间100-140min，提取温度55-65℃，提取1-2次，即完成提取。

本发明研究发现，温度变化是影响乌梅总多酚提取效果的极其重要的因素，提取效果在60℃时最佳，高于或低于60℃时，总多酚的提取率都会明显降低，因此，步骤(2)中，提取温度优选60℃，考虑到本发明实验设备在控温和升温时产生的误差，本发明提取温度优选为60℃±1℃。

另外，除了温度意外，乙醇浓度、料液比、提取时间等都对总多酚的提取效果有一定影响，根据相关提取条件对比实验，本发明拟定选择如下条件：

更进一步地，步骤(2)中，乙醇浓度为55-65％v/v；

更进一步地，步骤(2)中，料液比选自1：40-45；

更进一步地，步骤(2)中，提取时间为100-140min。

根据本发明目前的实验结果来看，超声提取1次即可实现对总多酚的有效提取。

其中，步骤(2)中，超声功率为100W。

超声提取法是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取方法。超声提取的主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。当大能量的超声波作用于介质时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时闭合，并产生高达几千个大气压的瞬间压力，即空化现象。超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大的压力，使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率。

本发明采用超声提取方法，对乌梅果实或叶中总多酚成分进行提取方法研究，找到了能够有效提取乌梅中的总多酚类成分的工艺条件，为乌梅总多酚类成分的进一步研究提供了基础。

本发明还提供了一种乌梅果实或叶的总多酚提取物，它是以7月采摘的生长在海拔约1800-2100m的乌梅果实或叶为原料，采用上述方法提取制得。本发明进行检测发现，不同月份的果实或叶中的总多酚含量有明显差异，其中，以7月份的果实或叶中总多酚含量最高，同时，生长在海拔1800-2100m的乌梅果实或叶中总多酚的含量明显比其他海拔条件下的原料要高，其中，又以海拔2100m为最。

该提取物能够提供总多酚含量最高的乌梅果实或叶提取物，为乌梅总多酚类成分的研究提供了基础。

本发明还提供了一种乌梅果实或叶中总多酚含量的检测方法，它包括如下操作步骤：

A、按照上述方法提取，获得提取液；

B、采用福林酚法测定总多酚含量即可。

本发明中提及的福林酚法，可以参考现有技术，例如，“赵小燕等，坚杆火绒草中总多酚的提取及含量测定，中国实验方剂学杂志，2015，21(9)：19-21”。

采用上述方法可以快速、较为准确的检测乌梅果实或叶中的总多酚含量，为乌梅果实或叶的质量检测提供了参考依据。

附图说明

图1乙醇浓度筛选结果

图2料液比筛选结果

图3提取时间的筛选结果

图4提取温度的筛选结果

具体实施方式

实施例1 乌梅果实中总多酚提取方法

(1)取乌梅果实，粉碎后，备用；

(2)以65％v/v乙醇为溶剂进行超声提取，料液比1：45g.ml^-1，提取时间100min，提取温度60℃，提取1次，即完成提取。

收集提取液，即得乌梅果实总多酚提取物。

实施例2 乌梅叶中总多酚提取方法

(1)取乌梅果实，粉碎后，备用；

(2)以55％v/v乙醇为溶剂进行超声提取，料液比1：40g.ml^-1，提取时间140min，提取温度60℃，提取1次，即完成提取。

收集提取液，即得乌梅叶总多酚提取物。

本发明上述实施例中所使用的超声功率为100W。

实施例3 提取条件的筛选以及总多酚含量检测方法

1.1仪器设备和参数设置：DHG-9246型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，双光束紫外可见分光光度计TU-1950(北京普析通用仪器有限责任公司)，十万分之一电子分析天平(AE240S，梅特勒-托利多(上海)有限公司)，艾柯超纯水机(AKPY-UP-1824，成都康宁实验专用纯水设备厂)，数显恒温水浴锅(HH-2，金坛市宏华仪器厂)。

1.2样品来源及制备：没食子酸(成都曼思特生物科技有限公司)，福林酚(成都曼思特生物科技有限公司)，碳酸钠、无水乙醇等试剂均为分析纯。

梅的果实和叶的样品采集于四川省阿坝州金川县(见表1)，经西南民族大学刘圆教授鉴定为蔷薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果实。样品经烘干粉碎后，过2号药典筛后分装于自封袋中，置于干燥器中保存，备用。

表1 样品来源

2方法与结果

2.1精密度试验：取0.5g干燥至恒重的梅的果实粉末0.5g，精密称定，在最优单因素条件下提取总多酚，分别测定其吸光度值。6次平行试验总多酚百分含量计算结果的RSD值为0.28％，结果表明精密度良好。取0.5g干燥至恒重的梅的果实粉末约0.5g，精密称定，加60％乙醇超声30min，提取液过滤后至25mL容量瓶中，定容至刻度。精密称取没食子酸0.00240g，用乙醇溶解并转移至25mL容量瓶中，定容，即得每1mL含没食子酸96μg的对照品溶液。

2.2重现性试验：取同一样品溶液，重复测定吸光度6次，RSD为0.41％(n＝6)。结果表明重现性良好。

2..3稳定性试验：取0.5g干燥至恒重的梅的果实粉末0.5g，精密称定，在最优单因素条件下提取总多酚。按照“2.5”项下方法显色，显色完成后第一次测量时间记为0min，第二次测量时间记为10min，依次类推，每隔10min测定其吸光度值，并带入标准曲线计算总多酚含量，结果在2h内总多酚含量RSD值为0.23％，表明样品溶液在显色2h之内稳定性良好。

2.4加样回收率试验：精密称定已知总多酚含量的样品粉末约0.5g，9份，依次加入不同量的没食子酸对照品，置圆底烧瓶中，按相同方法回流法提取，制备样品，以没食子酸对照品溶液作对比测定，计算总酚平均回收率为97.26％，RSD＝1.58(n＝9)。

2.5标准曲线制备

取4.95mg芦丁对照品，用65％乙醇配置，定容于50mL容量瓶中。精确量取0.5、1、2、3、4、5mL于10mL比色管中，加福林酚1.2ml，摇匀，再加入15％Na₂CO₃1mL,摇匀，用蒸馏水稀释至10mL后摇匀，放置60min。以不加没食子酸对照品溶液为空白，在734nm处测定吸光度。以对照品质量浓度(x，mg/mL)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线。得没食子酸的标准曲线方程为：y＝107.26x+0.1189，R²＝0.99972。

2.6样品提取方法考察：影响提取过程的主要因素有：显色条件、提取溶剂浓度、料液比、提取时间等。本试验采用单因素试验法，对主要的提取影响因素进行了考察。

2.6.1福林酚考察条件

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，以乙醇为提取溶剂，超声法提取1h，提取温度40℃，加入10％Na₂CO₃不同量的福林酚显色，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。结果表明，随着福林酚浓度的增大，吸光度呈上升的趋势，在福林酚加样量为1.2ml时，吸光度趋势线趋于平缓，故选择福林酚加样量为1.2ml。

2.6.2碳酸钠考察条件

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，以乙醇为提取溶剂，超声法提取1h，提取温度40℃，加入1.2ml福林酚和不同浓度的Na₂CO₃显色，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。结果表明，随着Na₂CO₃浓度的增大，吸光度呈上升的趋势，在Na₂CO₃浓度15％时，吸光度趋势线趋于平缓，故选择Na₂CO₃浓度为15％。

2.6.3反应时间和温度条件考察

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，以乙醇为提取溶剂，超声法提取1h，提取温度40℃，加入1.2ml福林酚和15％的Na₂CO₃显色，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。由下表可知，此反应体系在实验温度范围内热较稳定性好,吸光度呈上升的趋势，在反应时间为60min后达到稳定，故选择在室温下反应时间为60min。

表2

2.6.4乙醇浓度的选择

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，以不同浓度乙醇为提取溶剂，料液比1:20，超声法提取1h，提取温度40℃，加入1.2ml福林酚和15％的Na₂CO₃显色反应60min，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。由图1可知，当乙醇浓度为60％时，总多酚得率最大，随着乙醇浓度的继续增加，总多酚得率反而降低。故现在乙醇浓度为60％。

2.6.5料液比的选择

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，加入不同倍量的60％乙醇，超声法提取1h，提取温度40℃，加入1.2ml福林酚和15％的Na₂CO₃显色反应60min，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。由图2可知，随着料液比的增加，在40倍量料液比之后趋势线趋于平缓。故选择料液比为1:40g/ml。

2.6.6提取时间的选择

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，加入40倍量的60％乙醇，超声法提取，提取温度40℃，加入1.2ml福林酚和15％的Na₂CO₃显色反应60min，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。由图3可知，随着提取时间的增加，在提取时间为2h时总多酚提取率最高，在2h之后趋于平缓。故选择提取时间为2h。

2.6.7提取温度的选择

取乌梅粉末约0.5g，精密称定，加入40倍量的60％乙醇，超声法提取2h，加入1.2ml福林酚和15％的Na₂CO₃显色反应60min，于734nm处测定吸光度，带入标准曲线计算不同乙醇浓度提取所得总多酚的含量。由图4可知，随着提取温度的增加，总多酚呈先增大后减小的趋势，在60℃时总多酚提取率最高。故选择提取温度为60℃。

2.7综合因素考察试验

将上述筛选的部分效果较好的条件进行组合，并进行提取实验，检测总多酚含量，结果见表4。

表3

由上表可见：

(1)组1、2、4所得提取物中，总多酚含量明显高于其他6组，比较发现，这三组的提取温度与其他各组有差异，结合前述提取物温度选择的实验可知，温度对总多酚提取率的影响较大，且最佳温度应选择60℃。

(2)组1、2、4之间比较发现，组1、2提取物的总多酚含量高于组4，并且总多酚含量比组4显著提高了10％，比较之下可以发现，料液比可能是使得总多酚有此差异的关键因素，因此，优选料液比为1：40-45。

上述实验表明，对乌梅中总多酚的超声提取方法，以组1、2条件最佳。