一种2,6‑二取代吡啶‑4‑硫代甲酰胺的新用途的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
和食品领域，具体涉及一种2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺在制备苦味抑制药物或食品中的新用途。
背景技术：
：苦味是人体基本味觉之一。近年来，由于消费者健康意识的提高，出现了各类添加了功能性组分的食品、饮料等，对人体具有有用效应的所谓功能性组分通常都具有苦味，其必然会引起口味嗜好性降低，从而导致产品的吸引力降低。尽管苦味可以使一些食物味道鲜美，如啤酒、咖啡、黑巧克力和红酒等，但是在多数情况下，食物的苦味难以被人接受，而且若苦味过强，还会伴随着不愉快感乃至厌恶感。在医药行业，许多药物由于其本身具有难耐的苦味，在临床应用和剂型的开发上均受到了一定的限制，大多数味觉不佳的活性药物成分中也都具有苦味。药物的味道是影响病人服药依从性的重要因素，任何制剂处方，如果口感良好，都会胜于同类竞争产品，尤其是儿科用药，若口味易于小儿接受，可以大大提高用药依从性。因此，如何有效地去除苦味，提高患者的依从性和产品的价值，成为药物、食品研发过程中的重点内容之一。要减少苦味带来的不良味觉感受，就需要用苦味掩盖技术来降低产品的苦味强度。在不影响苦味物质本身功效的基础上，适当掩盖物质的苦味具有广泛的实际意义。从前人们掩盖食物苦味的方法是加入大量的蔗糖、食盐或者一些高脂肪物质，但是随着生活水平提高，人们更加注重养生和保健，从前传统的方法已经不能满足人们对食物低盐、低热量、低糖分的要求。在药物制剂工艺中，常常采用包衣、胶囊包裹、包合、微囊化等手段来掩盖苦味，但是，这些技术仅仅适用于固体制剂及成分单一的化学药物制剂等，并不能应用于大剂量、多组分的药物制剂中。中药是一种典型的苦味药物，其强烈的不良气味和味道导致中医治疗的优势大大地减弱，通常也会采用增加药物甜味以及增加香味的方法降低中药苦味的刺激。但许多药物苦度较高，只有通过有效的抑制，才能从根本上达到掩盖苦味的目的。因此，寻找一种具有安全、高效、稳定、廉价的苦味抑制剂成为一种迫切的需要。研究表明，苦味是通过g蛋白偶联受体(gpcrs)和位于味觉细胞细胞膜上的苦味受体(tas2rs或t2rs)而被感知的。gpcrs是味觉、气味、趋性、免疫、内分泌物以及神经传导物质最重要的受体，其在物质、能量的新陈代谢以及细胞信号转导中扮演着重要角色。苦味受体是一条具有7个跨膜螺旋结构的多肽链，属于gpcrs超家族的一员，在人体中已发现25个亚型，能够识别多种不同结构的苦味物质，与机体对苦味的感知密切相关。苦味物质与苦味受体蛋白结合后，由于胞内信使等将信号转导到细胞内，打开细胞膜上的钙离子通道使细胞外钙离子内流或与内质网膜上的钙离子通道结合使钙离子释放，从而导致细胞内钙离子浓度升高，使细胞膜去极化，引起神经细胞突触后神经元兴奋，兴奋性信号进入孤束核后再由神经中枢整合，最终使机体感受到苦味。苦味受体抑制剂主要通过阻塞苦味受体、阻断苦味信号传导等方式，以降低或消除苦味物质苦味的一类化合物。抑制剂和受体激动药竞争结合位点或与受体结合后引起变构现象而起抑制苦味作用。greene等在“probenecidinhibitsthehumanbittertastereceptortas2r16andsuppressesbitterperceptionofsalcin”中提出丙磺舒可以抑制被苯硫脲或丙硫氧嘧啶2种配体激活的htas2r38受体的活性，以及被芦荟苷激活的htas2r38受体活性，进而有效抑制水杨苷的苦味，为其在临床上作为苦味抑制剂奠定了基础。但是2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺对htas2r38苦味受体的抑制作用尚未见报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺在制备苦味抑制药物或食品中的新用途。本发明提供的2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺对苦味受体htas2r38具有明显的抑制作用。进一步地，所述的2，6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺结构如下：其中，r1为氢原子或烷基等，r2为氢原子或硫代甲酰胺。进一步地，所述2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺中r1为烷基。进一步地，所述2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺中烷基为甲基、乙基、丙基或异丙基。进一步地，所述2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺为2-甲基吡啶-4-硫代甲酰胺、2-乙基吡啶-4-硫代甲酰胺、2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺、2-异丙基吡啶-4-硫代甲酰胺或6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺，结构如下所示：本发明提供的2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺可单独应用于制备苦味抑制药物，还可以作为药物制备添加剂，复配形成组合物降低药物苦味。同时还可作为食品添加剂，调节食品的口味。在医药行业中，所述苦味抑制剂2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺可以制成任何一种适合于临床上的使用剂型，如制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、针剂、粉针剂、注射液或喷雾剂等。本发明首次公开2,6-二取代吡啶-4-硫代甲酰胺对苦味受体htas2r38具有抑制作用，且抑制效果明显。附图说明图1：2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺对hek293t细胞的荧光强度的影响；图2：2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺对钙离子浓度变化的浓度依赖性曲线；图3：2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺抑制苦味感官评价；图4：6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对hek293t细胞的荧光强度的影响；图5：6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对钙离子浓度变化的浓度依赖性曲线；图6：6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺抑制苦味感官评价。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，这些实施例仅用于例证的目的，并不限制本发明的保护范围。本发明所采用的hek293t细胞源自中国科学院细胞库；采用的ga16/gust44载体由日本名古屋大学takashiueda教授赠送；fluo4-am购自molecularprobes公司；2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺、6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺、丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，prop)购自sigma公司。所有化合物粉末都使用二甲基亚砜(sigma公司)充分溶解后-20℃保存备用。实施例1、2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺对苦味受体htas2r38功能的抑制prop为苦味受体htas2r38的激动剂，能够刺激并激活苦味受体，导致细胞中钙离子浓度发生变化。fluo4-am是fluo4的一种乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。am进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的fluo4随后会和钙离子(ca2+)结合并发出荧光。本研究用prop单独刺激或prop和2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺(prop+3)共同刺激转染并表达了苦味受体的hek293t细胞，通过荧光显微镜获取即时的荧光变化。本研究构建了苦味受体htas2r38的表达载体，采用重叠延伸pcr技术将视紫红质n端前39个氨基酸残基序列和htas2r38序列拼接在一起，以增强htas2r38在表达细胞表面的定位。另外，苦味受体在细胞内发挥其功能还需要偶联蛋白ga16/gust44的表达。将hek293t细胞培养于dmem完全培养基中，并置于37℃、5％co2的细胞培养箱中，2～3天消化传代一次，取处于对数生长期的细胞进行实验。将处于对数生长期的hek293t细胞铺在96孔板中，每孔约4×104～5×104个细胞，置于37℃、5％co2培养箱中过夜培养；待细胞完全贴壁后，将htas2r38和ga16/gust44质粒dna共转染进细胞中，培养4～6h后，去除无血清培养基，换用完全培养基培养，24h后去除培养基，并用检测缓冲液清洗细胞一次；每孔加入50μl浓度为5μm的fluo4-am，37℃孵育1h后去除fluo4-am；每孔加入50μl检测缓冲液，并将50μl不同浓度的2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺加入96孔板中，采用荧光显微镜观察细胞内荧光强度在180s内的变化趋势。荧光图像数据采用imagej软件进行分析，其他数据均采用graphpadprism5.0软件进行分析，每项实验重复3次；组间比较采用独立样本t检验，**表示p<0.01，差异具有显著性。f——各时间点的荧光强度f0——初始荧光强度由图1和图2可知：2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺对苦味受体htas2r38功能的抑制作用。图1可知，2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺降低细胞内荧光强度的效果明显，即其能明显抑制细胞内ca2+浓度升高，比较其最大荧光强度值，抑制率达到51.4％，表明2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺是苦味受体htas2r38的一种有效的拮抗剂。图2可知，2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺能够呈浓度依赖性的抑制prop诱导的htas2r38表达细胞内ca2+浓度升高；当浓度达到50μm时，曲线趋于平缓，半数抑制率(ic50)为16.99μm。实施例2、2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺抑制苦味的感官评价本研究通过人体对苦味的感官来验证苦味受体抑制剂对苦味的抑制作用。从课题组中筛选出了20名健康的志愿者(男10名、女10名)作为受试者，这些人需要对感官评价实验感兴趣，并且能够客观公正的对待感官评价实验，具有良好的语言表达能力及基本的感官辨别能力，在试验前签订了知情同意书。配置苦味物质和苦味抑制剂溶液。苦味物质及其浓度：氯化钾、糖精钠、咖啡因、盐酸奎宁、人工牛黄(商品化产品，非纯品)，参考食品添加剂中规定的用量和物质本身不同的苦味强度设置以上五种苦味物质最终浓度分别为1000、15000、2500、500、25ppm；待测苦味抑制剂及其浓度：r-氨基丁酸(一种已知苦味抑制剂，作为对照)和2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺。根据规定的食品添加剂的用量标准，确定待测苦味抑制剂r-氨基丁酸的浓度为200ppm，根据半抑制浓度和可用剂量确定2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺的浓度为200ppm。采用钠盐形式配置苦味抑制剂溶液，精确称取0.2g的r-氨基丁酸，溶解于100ml纯净水中，加入碳酸氢钠至溶液ph＝7，倒入1000ml的容量瓶中定容，即配制成浓度为200ppm的r-氨基丁酸(钠盐)溶液。将苦味抑制剂溶液等体积加入到苦味物质中，即得混合溶液。使用同样的溶解方式溶解0.2g的2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺，并将2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺溶液和苦味物质混合形成混合溶液。让感官评价人员品尝混合后溶液的苦味强度，用纯水作空白对照实验，已知苦味抑制剂r-氨基丁酸作为阳性对照。感官评价人员保持品尝的混合溶液在口中连续转动但不吞入，使样品流经舌头的每一部位，一个样品测试完后需要大量清水漱口，两个相邻的样品溶液品尝间隔需要在15min以上，以保证测试结果的准确度和可靠度。评价结果用数值表示，每项实验重复3次，最后计算其平均值。参考下表的评分标准，分值为0-10分。数据均采用graphpadprism5.0软件进行分析，每项实验重复3次；组间比较采用独立样本t检验，**表示p<0.01，差异具有显著性。苦味评分标准如下表1：表1苦味程度的评分标准苦味强度对应的分数不苦0-2较苦2-4苦4-6很苦6-8极苦8-10由图3可知：2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺对于苦味具有很明显的抑制作用，其抑制苦味的能力要优于阳性药r-氨基丁酸，对于不同的苦味刺激物质其抑制苦味的能力也有所不同。实施例3、6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对苦味受体htas2r38功能的抑制本研究用prop单独刺激或prop和6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺(prop+5)共同刺激转染并表达了苦味受体的hek293t细胞。研究方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，将2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺替换为6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺。由图4和图5可知：6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对苦味受体htas2r38功能的抑制作用。图4可知，6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺能够极显著的抑制prop引起的细胞内钙离子浓度的变化，其抑制率达到66.0％，表明6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对于苦味受体具有很好的抑制效果。图5可知，6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对于prop刺激的钙离子浓度的升高具有一个浓度依赖性的抑制作用，当浓度达到50μm时，抑制曲线开始趋于平缓，其ic50值为13.99μm。实施例4、6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺抑制苦味的感官评价研究方法与实施例2类似。与实施例2的区别在于，将2-丙基吡啶-4-硫代甲酰胺替换为6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺。由图6可知：6-甲基吡啶-2,4-二硫代甲酰胺对于不同物质的苦味具有不同程度的抑制作用，对于氯化钾、糖精钠、盐酸奎宁和咖啡因的苦味具有显著性的抑制作用，并且其苦味抑制效果要优于阳性药r-氨基丁酸。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明的进一步详细说明，应当指出的是，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属的
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，这些推演或替换都应当视为本发明的保护范围。当前第1页12