松果菊苷的新应用的制作方法

本发明涉及松果菊苷的新用途。

背景技术：

糖尿病肾病是糖尿病的一种最常见也是最严重的并发症，最终将导致终末

期肾脏疾病(esrd)是糖尿病患者最重要的死亡原因；近年来，随着人们生活方式以及饮食习惯的改变导致糖尿病的患病率逐年增长；相关流行病调查表明，成年人糖尿病患者将由2010年的2.85亿增长2030年的4.39亿，也就是截止到2030年全球糖尿病患者相比2010年增长了一倍多。

糖尿病肾病在临床上以持续性白蛋白尿和(或)肾小球滤过率(gfr)进行性下降为主要特征；其典型的肾脏形态学改变包括：肾小球基底膜增厚、系膜基质增宽、肾小球硬化、足细胞丢失；肾小管基底膜增厚、肾小管萎缩及细胞凋亡增加、肾间质炎性浸润、肾间质纤维化、管周毛细血管稀疏；出入球小动脉壁玻璃样变，尤以出球小动脉的玻璃样变更具特征性。

对于dn的发展有以下几个风险因素：持续长时间的糖尿病、诊断年龄、种族、系统性或肾小球源性高血压、血糖控制不佳、遗传、肾脏疾病的易感性以及饮食。

目前糖尿病肾病的发病机制尚不明确，肾纤维化常发生于糖尿病肾病，最终会导致终末期肾衰竭；肾纤维化是细胞外基质(ecm)积聚过多的结果，其中转化因子β(tgf-β)被认为是诱导上皮间质转化(emt)的主要调节因子；同时tgf-β可能通过蛋白激酶和转绿因子等多种细胞内信号转到通路来促进纤维化的产生，因此tgf-β在dn的发展中起到非常重要的作用。

目前对于糖尿病肾病的治疗主要是控制血糖、降低血压、减少尿蛋白、控制高血脂、低蛋白饮食、纠正水电解质代谢紊乱等治疗，这些治疗只能延缓糖尿病肾病的进展，但根本不能阻止esrd的发生，传统的中药在治疗糖尿病肾病方面有着悠久的历史，但是其具体的作用机理的研究相对落后。

因此，深入开展糖尿病肾病发病机理及中药的作用机理的研究，将作为中药新药研究开发机糖尿病肾病的临床治疗提供重要的科学依据。

松果菊苷(ech)是从肉苁蓉中分离出来的一种天然苯乙醇物，肉苁蓉是中药中常用的药物之一，它主要用来增强肾功能，治疗阳痿、早泄男性不孕，妇女的带下、血崩和老年人的慢性便秘。之后对松果菊苷的研究中发现其具有护肝、抗纤维化、抗氧化、抗凋亡等作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供松果菊苷在预防、缓解和/或治疗糖尿病肾病的新用途。

本发明提供松果菊苷在制备治疗糖尿病肾病药物中的用途。

本发明还挺一种治疗糖尿病肾病药物，它是以松果菊苷为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

所述制剂是注射制剂或口服制剂。

经试验证明，ech具备如下作用：(1)能显著降低体重和血糖水平；(2)显著降低24小时尿蛋白含量；(3)显著降低肾脏重量、血bun和血cr水平；(4)减少肾间质纤维化的含量以及减少系膜基质的沉积；(4)显著降低肾脏内α-sma升高e-cadherin的表达水平；(5)显著降低肾脏内fn和collagenⅳ表达水平。

附图说明

图1是db/m、db/db和db/db+ech组小鼠的体重、血糖结果图；

其中：a为小鼠体重结果图；b为空腹血糖水平统计图；

图2是db/m、db/db、db/db+ech组小鼠病理结果图；

a图为he染色图；

b图为masson染色图；

c图为pas染色图；

d图为间质纤维化百分比柱状图；

e图为系膜基质百分比。

图3为db/m、db/db、db/db+ech组小鼠肾脏内与上皮间质转化相关因子e-cadherin、α-sma免疫组化及结果统计柱状图；

a图为e-cadherin、α-sma免疫组化镜下图；

b图为e-cadherin免疫组化柱状统计图；

c图为α-sma免疫组化柱状统计图。

图4为db/m、db/db、db/db+ech组小鼠肾脏内反应间质纤维化的相关因子fn、collagenⅳ的免疫组化及结果统计柱状图；

a图为fn、collagenⅳ的免疫组化镜下图；

b图为fn免疫组化柱状统计图；

c图为collagenⅳ免疫组化柱状统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

小鼠和基因工程小鼠资源是目前疾病机制研究、基因功能研究、药物创制等领域最重要的动物模型之一，也是这些领域创新研究的必须条件。利用基因工程小鼠针对糖尿病肾病病理过程中的各个分子环节进行研究，对阐明糖尿病肾病发生发展过程中的分子机制，寻找糖尿病肾病治疗的有效药物具有重要的意义。

本发明以遗传背景为c57blks/j的雄性db/db小鼠和db/m小鼠为实验对象，均给予普通饲料喂养，结果表明与db/m小鼠对比，db/db小鼠表现出明显的肥胖，其体重明显高于db/m小鼠，并且db/db小鼠空腹血糖，24小时尿蛋白明显高于对照组db/m小鼠。从小鼠肾脏he、pas以及masson染色说明db/db组小鼠肾脏病变严重，肾小球体积增大，系膜基质增生、基地膜增厚，肾间质纤维组织增多，这表明db/db小鼠出现了糖尿病肾病的表现。而通过灌胃给予ech喂养后发现ech能显著降低db/db小鼠体重、空腹血糖以及24小时尿蛋白含量，同时db/db小鼠肾脏病理改变明显改善。这表明db/db小鼠产生糖尿病肾病的改变，ech对糖尿病肾病具有保护作用。

实验用动物及饲养

实验动物种属，性别，周龄及来源：遗传背景为c57blks/j的db/m小鼠与db/db小鼠，雄性，8周龄，体重db/m为20-25g，db/db为40-48g。db/m与db/db小鼠购自南京大学-南京生物医药研究院(质量合格证号：db/db：32002100000734，db/m：32002100000735)。

(22)动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠饲养在武汉大学人民医院动物饲养中心spf级动物房(许可证号：syxk(鄂)2009-0027)。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

实验所用药物：松果菊苷(ech)购买于上海融禾医药科技发展有限公司，货号(150623)

【实施1】小鼠体重，血糖水平测定以及24h尿液收集与检测

(1)小鼠空腹体重，眶静脉窦采血。

1)体重检测

①禁食：晚上10：00将待实验小鼠禁食(不禁水)，第二天上午8：00开始实验操作。

②称重：分别在小鼠年龄的8周、10周、12周、14周、16周、18周称重，将一铁饭盒放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量饭盒中，称量体重记录数据。

2)腹腔注射戊巴比妥麻醉小鼠后眶静脉采血，分离血清。

①麻醉：将戊巴比妥粉末用生理盐水配置成3％浓度，小鼠腹腔注射，0.1ml/10g麻醉小鼠。

②常规抓取小鼠，置于采血台上，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。

③右手持采血管，将尖端与小鼠面部成45°的夹角，沿内眦插入内眼入滑眼球后方，向眼底方向刺入，当感到有阻力时即旋转轻采血管以切开静丛，血液即流入采血管。

④缓慢调整采血管的角度使之水平或稍向下倾斜，辅助者将0.5mlep管置于采血管末端的下方收集血液，并在0.5mlep管上标上耳标号。采血结束后，拔出采血管，放松左手，使用无菌纱布块轻轻压迫眼眶帮助止血。

⑤分离血清：收集血液的ep管于室温下静置1-2h使血液自然凝固。4℃，4000rpm/min，离心30min，充分分离血清。用微量移液器分别吸取血清置无菌ep管中，对ep管进行标记，随后保存于-80℃冰箱。

(2)空腹血糖水平检测

将所有待实验的小鼠从晚上10:00到第二天上午8：00间禁食(不禁水)，即禁食10小时后开始实验操作，分别在小鼠年龄的8周、10周、12周、14周、16周、18周检测血糖。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，onetouch)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

(3)24小时尿液收集与尿蛋白检测

1)24小时尿液收集：上午8:00将小鼠放入代谢笼中(不禁食、不禁水)，到第二天上午8:00时收集尿液，在小鼠年龄的10周、14周、18周收集，将所收集的尿液装与1.5ml的ep管中，4℃，3000rpm/min,离心15min，将上清置于1.5ml无菌ep管中，对ep管进行标记，随后保存于-80℃冰箱。

2)小鼠24小时尿蛋白检测

①从-80℃冰箱中取出血清样本，迅速置于冰上，在室温下待样品融化；

②在室温下，3000转/分钟离心1分钟，让ep管壁的尿液聚集至管底。

③按照操作流程，打开全自动生化分析仪(johnson&johnson)，清洗加样器。

④按照全自动生化分析仪样品盘的标记顺序，逐一放入待测的ep管。

⑤准确安装试剂检测盘，开始使用全自动生化分析仪检测尿蛋白水平。

【实施2】小鼠血清bun、cr含量测定

①从-80℃冰箱中取出血清样本，迅速置于冰上，在室温下待样品融化；

②在室温下，4000转/分钟离心1分钟，让ep管壁的血清聚集至管底。

③按照操作流程，打开全自动生化分析仪(johnson&johnson)，清洗加样器。

④按照全自动生化分析仪样品盘的标记顺序，逐一放入待测的ep管。

⑤准确安装试剂检测盘，开始使用全自动生化分析仪检测bun、cr水平。

糖尿病肾病损伤严重程度的评价指标主要包括体重、血糖、24小时尿蛋白含量、血bun及血cr水平，这些指标均与糖尿病肾病严重程度正相关。体重、血糖结果如图1所示，我们发现db/db小鼠随着时间的延长体重与血糖明显高于db/m小鼠。给予ech干预(灌胃或注射)的db/db小鼠，在干预第10周时db/db+ech组小鼠血糖与体重较db/db组明显降低(见图1a、b)，表明ech有利于糖尿病肾病小鼠的血糖与体重的作用。

经24小时尿蛋白含量检测发现db/db小鼠从小鼠年龄的10周开始，24小时尿蛋白含量明显高于db/m小鼠，且随着时间的延长尿蛋白含量也增高，经过ech干预后小鼠尿蛋白含量显著降低(见表1)。检测小鼠血清中bun与cr发现db/db小鼠血清中bun及cr均高于db/m小鼠，经ech干预10周后，db/db小鼠血清中bun与cr水平显著降低(见表2)，表明ech对糖尿病肾病具有保护作用。

【实施3】肾脏重量，肾脏显微结构的检测

1.终末肾脏组织取材

小鼠干预至10周时，称重，用3％戊巴比妥钠，0.1ml/10g麻醉小鼠，用枕头固定于取材板，用纱布湿润小鼠胸腹部皮肤，用眼科剪剪开胸腔与腹腔，暴露心脏与肾脏，剪开右心耳，把注射器的针头刺进左心室，用5050ml注射器缓慢推注10-15mlpbs缓冲液，待右心耳流出液清亮，灌流结束后，清除腹腔脏器，仅保留肾脏，用镊子将双侧肾脏包膜剥离，称重，右侧肾脏放入有4％多聚甲醛的15ml离心管中，左侧肾脏放入ep管中，标记于-80℃冰箱保存。

2.肾脏组织处理及病理染色相关实验

1)肾脏脱水，透明，浸蜡

切取4％多聚甲醛中固定好的部分肾脏组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水：75％酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时)；②透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；③浸腊(65℃)：石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。

2)肾脏组织切片(切片厚度4um)

3)肾脏组织苏木精-伊红(he)染色

将肾脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次)→100％酒精(1分钟)→90％酒精(1分钟)→70％酒精(1分钟)→蒸馏水洗→苏木素(5分钟)→自来水洗去切片上的浮色→1％盐酸酒精(1至3秒)→自来水洗数下→scott促蓝液(碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100ml)(1分钟)→自来水洗数下→伊红(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。

3.肾脏组织masson染色

1)石蜡切片脱蜡至水(方法和上述所用方法一样)；

2)依次用自来水和蒸馏水洗数分钟；

3)用harris氏苏木素液染核1-2min；

4)充分水洗，如过染可用盐酸酒精分化2-3s；

5)自来水反蓝；

6)用masson丽春红酸性复红液5min；

7)1％磷钼酸水溶液分化5min(镜下观察，着色程度)；

8)1％苯胺蓝液染5min；

9)1％冰醋酸水溶液分化几秒(镜下观察，着色程度)；

10)脱水透明，中性树脂封片，待晾干后在显微镜下观察，拍照。

11)肾间质纤维组织百分比测定：使用image-proplus6.0图像分析软件圈纤维化面积/整个图片面积。

4.肾脏pas染色

1)切片常规用二甲苯脱蜡2次，每次10mim；

2)无水乙醇、95％、80％、70％各级乙醇依次脱水至蒸馏水，每次5mim，后pbs漂洗3次，每次2min；

3)侵入过碘酸溶液15min，流水冲洗5min，擦干切片上多余水分；

4)schiff液染色10min；

5)流水冲洗(着色较深颜色的切片可缩短时间)；

6)用harris氏苏木素液染核1-2min，流水冲洗；

7)1％盐酸酒精分化，水洗；饱和碳酸锂处理，水洗；

8)上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，待晾干后显微镜下观察，拍照。

9)细胞基质所占半分比：：使用image-proplus6.0图像分析软件圈细胞基质面积/肾小球面积。

细胞外基质(emc)积聚、弥漫性和结节性肾小球系膜扩张和基底膜(gbm)增厚是糖尿病肾病的主要的病理变化，在糖尿病肾病的患者中随着尿蛋白的不断的增加，足细胞会发生相应的减少。本发明中可以观察到松果菊苷的干预能减轻系膜细胞和系膜基质的增生以及基底膜增厚的情况和减少足细胞的丢失(见图2)。

【实施4】肾脏组织内e-cadherin、α-sma、fn及collagenⅳ表达的测定

免疫组化染色检测肾脏组织内e-cadherin、α-sma、fn及collagenⅳ的表达。所需一抗信息：e-cadherin(1:100rabbit；abcam)α-sma(1:200rabbit；abcam)、fn(1:100rabbit；abcam)及collagenⅳ(1:100rabbit；abcam)；二抗信息goatanti-rabbitigg(1:1,000goat；abcam),hrp(1:1,000；abcam)。

主要步骤为：

1)取石蜡切片，放入55℃烤箱中烤片30min；

2)常规脱蜡入水：二甲苯ⅰ10min，二甲苯ⅱ10min，100％酒精5min，2次，95％酒精5min，80％酒精5min，70％酒精5min，蒸馏水5min，蒸馏水5min；

3)pbs洗4次，每次2min，擦拭干净；3％h2o2常温孵育切片20min；将切片放入抗原修复液柠檬酸钠中，放入煮沸的高压锅中煮沸20min；

4)取出，直接将盒子放在冰上冷却至室温，蒸馏水浸洗2次，每次2min，pbs浸洗2次，每次2min；

5)滴加一抗(稀释到适当的比例)，滴加一抗时注意让液体覆盖切片上所有组织，放入湿盒中，4℃孵育过夜；

6)从4℃冰箱中取出，室温放置30min，复温，置于摇床上用pbs洗4次，每次5min；

7)滴加二抗，放入湿盒中37℃孵育1h；

8)置于摇床上pbs洗4次，每次5min；

9)dab显色剂显色(1:150稀释)，显微镜下观察颜色变化程度，自来水冲洗数分钟；

10)苏木素液复染60s，自来水返蓝15min；

11)梯度酒精脱水：

12)中性树脂封片，晾干后，在显微镜下观察拍照

定量分析：使用image-proplus6.0图像分析软件对阳性结果吸光度(iod)测定。

肾小管上皮细胞可以转化为间质成纤维细胞或肌成纤维细胞，而后者作为组织纤维化的效应细胞，直接参与纤维化的过程，说明上皮间质转化(emt)在糖尿病肾病的发展中起着非常重要的作用。正常状态下肾小管上皮细胞通过细胞间黏附机制紧密连接在一起，e钙黏蛋白(e-cadherin)是组成肾小管上皮细胞间紧密连接的重要成分，在保持细胞完整性和极性中起重要作用。emt发生的过程中α-sma表达升高而e-cadherin表达降低。上述结果显示在db/db小鼠肾脏内α-sma表达升高而e-cadherin表达降低，给予ech干预后α-sma表达显著下降，e-cadherin显著升高(见图3)。fn是一类重要的高分子糖蛋白，在正常肾组织主要分布于肾小球系膜区，彼此以纤维状结构相连，对维持肾小球正常结构起着重要的作用，collagenⅳ以胶原蛋白的非纤维形式存在，主要由上皮细胞、间质细胞、系膜细胞产生，它穿透整个gbm形成胶原纤维网并通过结合细胞黏附分子起到机械屏障作用，在ecm增殖中占主要成份，fn和collagenⅳ是细胞外基质的主要成分，上述结果显示db/db小鼠肾脏组织中fn和collagenⅳ均显著升高，经过ech干预后fn与collagenⅳ显著下降(见图4)。这些结果表明ech可显著改善糖尿病肾病病理状态，对糖尿病肾病具有保护作用。

附表

表1

表2

图1是db/m、db/db和db/db+ech组小鼠的体重、血糖结果图，结果表明ech在干预10后，显著降低db/db小鼠体重和血糖水平(**:p﹤0.01vsdb/m组，#:p﹤0.05vsdb/db组，##:p﹤0.01vsdb/db组)。

a为小鼠体重结果图；

b为空腹血糖水平统计图

表1是db/m、db/db、db/db+ech组小鼠的24小时尿蛋白含量表，结果表明ech能显著降低db/db小鼠24小时尿蛋白含量(**:p﹤0.01vsdb/m组；#:p﹤0.05vsdb/db组)。

表2是db/m、db/db、db/db+ech组小鼠的肾脏重量、血bun和血cr水平，结果表明ech能显著降低db/db小鼠肾脏重量、血bun和血cr水平(**:p﹤0.01vsdb/m组；##:p﹤0.01vsdb/db组)。

图2是db/m、db/db、db/db+ech组小鼠病理结果图，结果表明ech明显改善db/db小鼠肾脏的病理改变，减少肾间质纤维化的含量以及减少系膜基质的沉积(*:p﹤0.05vsdb/m组；#:p﹤0.05vsdb/db组)。

a图为he染色图；b图为masson染色图；c图为pas染色图；

d图为间质纤维化百分比柱状图；e图为系膜基质百分比。

图3为db/m、db/db、db/db+ech组小鼠肾脏内与上皮间质转化相关因子e-cadherin、α-sma平免疫组化及结果统计柱状图，结果表明ech显著降低肾脏内α-sma升高e-cadherin的表达水平(*:p﹤0.05vsdb/m组，**:p﹤0.01vsdb/m组；#:p﹤0.05vsdb/db组，##:p﹤0.01vsdb/db组)。

图4为db/m、db/db、db/db+ech组小鼠肾脏内反应间质纤维化的相关因子fn、collagenⅳ的表达水平免疫组化及结果统计柱状图，结果表明ech显著降低肾脏内fn和collagenⅳ表达水平(*:p﹤0.05vsdb/m组，**:p﹤0.01vsdb/m组；#:p﹤0.05vsdb/db组，##:p﹤0.01vsdb/db组)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分均属于现有技术。

应当理解的是，上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换或变形，均落入本发明的保护范围之内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。