本发明涉及抗肿瘤药物领域，特别是指氯胍在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：癌症是严重影响居民健康的危险因素，近十年来全球范围内癌症负担呈持续增长态势，在我国肿瘤死亡占全部死因的1/4，位居死亡第一位。癌症不仅给患者家庭和社会带来沉重负担，也对公共安全和社会稳定造成影响。膀胱癌是世界范围内泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，膀胱癌的发病率在全球肿瘤患者中居于前列，并逐年攀升，在我国男性肿瘤中居第七位。膀胱癌属于尿路肿瘤，与其他癌症存在异质性，也有其特殊的临床治疗方法-膀胱灌注，常用药物包括吡柔多星在内的丝裂霉素、阿霉素和表柔比星等，但均存在不同程度的毒副作用。氯胍常用于预防恶性疟、良性疟和治疗恶性疟，毒性很小，但疟原虫对氯胍易于产生耐药性，且奏效缓慢，故已少用。以往对氯胍的研究往往集中于对二氢叶酸还原酶的抑制作用以及对于疟疾的治疗，但对于氯胍用于抗肿瘤的研究目前未见报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提出氯胍在制备抗肿瘤药物中的应用，该抗肿瘤药物通过激活ampk信号通路能够发挥抑制肿瘤的效果，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。基于上述目的本发明提供了氯胍在制备抗肿瘤药物中的应用。优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤或良性肿瘤。更优选地，所述恶性肿瘤包括膀胱瘤、黑色素瘤、乳腺瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、非黑色素瘤性皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌和中枢神经系统肿瘤中的一种或多种。更优选地，所述良性肿瘤包括甲状腺腺瘤、肾上腺皮质腺瘤、垂体腺瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤和脑膜瘤中的一种或多种。本发明还提供了氯胍在制备抑制肿瘤原发性生产和/或转移性生长药物中的应用。优选地，所述肿瘤包括女阴上皮性癌、宫颈癌、子宫内膜腺癌、卵巢癌和眼黑色素瘤中的一种或多种。优选地，所述抗肿瘤的药物或抑制肿瘤原发性生长和/或转移性生长的药物为氯胍单一成分或含有效剂量氯胍的药物组合物、药物混合物或分子结构修饰物。更优选地，所述药物组合物为含有有效剂量氯胍的复方制剂或经药学上接受的载体包装后的药物；所述药物混合物为药学上接受的药物与有效剂量的氯胍混合而成；所述分子结构修饰物为在氯胍基本结构的基础上，进行一系列化学修饰得到的化合物，其中化学修饰方式包括成盐修饰、酯化和酰胺化修饰、氨甲化修饰、醚化修饰和环化修饰中的一种或多种。优选地，所述抗肿瘤的药物或抑制肿瘤原发性生长和/或转移性生长的药物为固体制剂、半固体制剂或液体制剂。氯胍是双胍类的化合物，其结构式如式(i)所示：本发明人经研究发现，氯胍在抗肿瘤方面表现出良好的疗效，其机理可能如下：氯胍通过靶向肿瘤细胞能量代谢中的关键蛋白ampk发挥强大的抑癌效应，ampk即amp依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，是研究代谢相关疾病的核心，同时ampk信号通路在肿瘤起始和进展中也发挥潜在作用，ampk是治疗多种癌症的潜在治疗靶点，ampk的激活进而引发信号通路上游的p53-p21的上调和下游的mtor的下调，从而起到抑制肿瘤的效果。本发明中所使用的术语“抗肿瘤作用”是指使肿瘤的生长、生长速率、尺寸、扩散、转移得以减慢以及预防个体体内肿瘤的发生和/或复现。本发明中所述药物可以为氯胍单一成分或含有效剂量氯胍的药物组合物、药物混合物或分子结构修饰物。其中，药物组合物为含有有效剂量氯胍的复方制剂或经药学上接受的载体包装后的药物；所述载体的特征为微球、微乳液、高分子表面活性剂、植入剂、脂质体；所述药物混合物由药学上接受的药物与有效剂量的氯胍混合而成；所述分子结构修饰物为在氯胍基本结构的基础上，进行一系列化学修饰得到的化合物，其中化学修饰方式包括成盐修饰、酯化和酰胺化修饰、氨甲化修饰、醚化修饰和环化修饰中的一种或多种。“药学上可接受的载体”意味着与靶向输送组织物混合和/或向受试者递送靶向输送组合物的任何药学上可接受的手段；本发明中的“药学上可接受的载体”意味着参与将受试药剂从生物体的一个器官或部分搬运或转运至生物体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料，如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料；从与制剂的其他成分相容的意义上来说，载体必须是“可接受的”，并且载体与受试者进行的给予是相容的。本发明中所述的载体可包括本领域已知的任何缓释材料，例如单独使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯及其与蜡的混合物。本发明中所述药物可以用于治疗下述的恶性肿瘤或良性肿瘤；恶性肿瘤即致癌肿瘤或癌症，癌症通常意味着以出现恶性肿瘤作为症状的一组疾病，这些恶性肿瘤由非典型的细胞组成，具有自主生长的能力、不明确的界限、侵入邻近组织和血管的能力以及通过产生转移瘤进行播散的倾向，本发明中所述的恶性肿瘤包括膀胱癌、黑色素瘤、乳腺瘤、非霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、非黑色素瘤性皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌和中枢神经系统肿瘤中的一种或多种；本发明中所述的良性肿瘤包括甲状腺腺瘤、肾上腺皮质腺瘤、垂体腺瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤和脑膜瘤中的一种或多种。本发明中所述药物还可以用于抑制下述肿瘤的原发性生长和转移性生长，所述肿瘤包括女阴上皮性癌、宫颈癌、子宫内膜腺癌、卵巢癌和眼黑色素瘤中的一种或多种。本发明中所述药物为固体制剂、半固体制剂或液体制剂，例如悬浮液或气雾剂等；优选以适合于单此给予精确剂量的单位剂型给予药物。本发明中所述药物可以为缓释制剂或定时释放制剂；通过使用聚合物络合或吸附氯胍和/或化疗剂可以获得控释制剂；通过选择适当的大分子并选择大分子的浓度以及并入方法以控制释放，实现受控递送，所述大分子可以为聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-醋酸乙烯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白；所述药物还可以为定时释放制剂，定时释放制剂可以全天提供即时释放和脉冲释放的组合；所述药物中还可以包括药学上可接受的稀释剂，药学上可接受的稀释剂和氯胍组成药物组合物，稀释剂可以为蒸馏水、生理盐水、林格式溶液、右旋糖溶液；另外，本发明所述的药物组合物中还可以包括其他载体、佐剂、乳化剂或者无毒的、非治疗性的且无致免疫性的稳定剂等。从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：本发明发现了氯胍用于肿瘤治疗，氯胍通过靶向肿瘤细胞能量代谢中的关键蛋白ampk发挥强大的抑癌效应，ampk的激活进而引发信号通路上游的p53-p21的上调和下游的mtor的下调，从而起到抑制肿瘤的效果，具有广阔的应用前景。附图说明图1为本发明实施例中氯胍抗肿瘤活性与细胞毒性试验效果图；图2为本发明实施例中氯胍抑制肿瘤细胞克隆试验效果图；图3为本发明实施例中氯胍激活ampk试验效果图；图4为本发明实施例中氯胍抑制肿瘤生长动物试验效果图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。实施例1氯胍抗肿瘤活性与细胞毒性试验一、实验材料人膀胱癌细胞系umuc3购自上海兴泊生物科技有限公司；人膀胱癌细胞系t24购自上海兴泊生物科技有限公司；人膀胱癌细胞系a549购自上海兴泊生物科技有限公司；氯胍购自sigma-aldrich公司。二、实验方法及结果取处于对数期的人膀胱癌细胞系umuc3、人膀胱癌细胞系t24和人膀胱癌细胞系a549，分别按照每孔7000个细胞进行种板，将接种完的培养板均放置于培养箱中过夜，然后分别用0μm、3.125μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm的氯胍处理，处理完成后将培养板均放回培养箱中培养48小时，然后用mtt比色法检测细胞生存率，并分别计算ic50值，实验结果如图1所示。由图1可知，氯胍抑制人膀胱癌细胞系umuc3、人膀胱癌细胞系t24和人膀胱癌细胞系a549的ic50值分别为23.48μm、19.21μm、3.86μm，氯胍抗肿瘤活性高。实施例2氯胍抑制肿瘤细胞克隆试验一、实验材料10％的福尔马林购自国药集团化学试剂有限公司；结晶紫染液购自sigma-aldrich公司。二、实验方法及结果取处于对数生长期的人膀胱癌细胞系umuc3、人膀胱癌细胞系t24和人膀胱癌细胞系a549，分别按照每孔6000个细胞接种于24孔培养板，将接种完的培养板均放置在培养箱中过夜，使细胞贴壁；然后分别将24孔培养板中的培养基吸出，分别给予0μm、0.78μm、1.56μm、3.125μm、6.25μm、12.5μm的氯胍处理，处理完后将培养板均放回培养箱中继续培养一周；然后，分别用10％的福尔马林固定20分钟，并用500μl结晶紫染液染色，最后回收结晶紫染液；之后，分别将24孔板流水冲洗干净，并将24孔板倒置放在滤纸上，干燥后用显微镜(leica，dfc450c，wetzlar，germany)拍摄图像和酶标仪(biotek，synergyhtx，vermont，usa)进行定量分析，实验结果如图2所示。由图2可以看出，氯胍对人膀胱癌细胞系umuc3、人膀胱癌细胞系t24和人膀胱癌细胞系a549的集落形成均具有明显的抑制作用，并且随着氯胍浓度的升高，氯胍对人膀胱癌细胞系umuc3、人膀胱癌细胞系t24和人膀胱癌细胞系a549的集落形成的抑制作用增强，即氯胍对人膀胱癌细胞系umuc3、人膀胱癌细胞系t24和人膀胱癌细胞系a549的集落形成的抑制作用呈现浓度依赖性。实施例3氯胍激活ampk试验一、实验材料细胞裂解液购自bio-rad公司；tbs缓冲溶液购自hyclone公司；β-actin抗体、t-4ebp1抗体、p-4ebp1抗体、t-70s6k抗体、p-70s6k抗体、t-thr172-ampk抗体和p-thr172-ampk抗体均购自cellsignaling,beverly,ma,usa公司。二、实验方法及结果向人膀胱癌细胞系t24、人膀胱癌细胞系umuc3中分别加入氯胍使其终浓度为0、0.19、0.38、0.75、1.5μm，培养24小时后，吸弃培养液，分别加入300μl的细胞裂解液，震荡30分钟，将细胞刮下，4℃离心(14000×g)10min，用bca法进行蛋白定量；将定量的蛋白在100℃水浴5min变性后，用微量进样器取20μg的蛋白质与5μl的marker加入电泳槽的加样孔中，用200v电压进行电泳50min；在转膜仪上将电压调至100v，转膜90min转到pvdf膜上；然后进行免疫反应：用tbs缓冲溶液浸湿pvdf膜后，用封闭液封闭，25℃下摇床上1h，一抗加入β-actin抗体或t-4ebp1抗体或p-4ebp1抗体或t-70s6k抗体或p-70s6k抗体或t-ampk抗体或p-thr172-ampk抗体，4℃下摇床过夜，再用tbst溶液在室温下25℃摇床上洗5min，共洗3遍。然后孵育二抗，之后进行化学发光反应显影。用以上同样的方法对药物作用后的umuc3、t24细胞进行westernblot检测蛋白的表达，实验结果如图3所示。由图3可以看出，氯胍有强大的激活ampk效应，且从激活幅度来看，对umuc3膀胱肿瘤细胞的作用高于对t24膀胱肿瘤细胞的作用；同时，氯胍对ampk信号通路的下游4ebp1和70s6k的抑制作用增强，从抑制的幅度来看，也是对umuc3膀胱肿瘤细胞的作用强于对t24膀胱肿瘤细胞的作用，这些结果与前述氯胍抑制该类肿瘤细胞生长的活性一致。实施例4氯胍抑制肿瘤生长动物试验一、实验材料健康雌性c57bl-6小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司二、实验方法及结果健康雌性c57bl-6小鼠，6周龄，在检疫室观察1周后随机分组，每组6只小鼠，造模并称重。实验方案由湖南师范大学动物伦理委员会进行审查并予以批准。所有实验均按照相关准则和条例进行。(1)原位小鼠膀胱癌模型的建立：选取对数生长期，生长良好的小鼠膀胱癌mb49细胞，经消化、离心后制成单细胞悬液，之后计数并确定细胞密度。按照常规方法对小鼠进行膀胱癌细胞植入。(2)膀胱灌注：将小鼠随机分为4组(每组12只小鼠)，ⅰ-未植入肿瘤空白对照组；ⅱ-膀胱灌注氯胍，剂量为0.75mm，50ul每周2次，共2周；ⅲ-膀胱灌注氯胍，剂量为0.20mm，50ul每周2次，共2周；ⅳ-植入肿瘤对照组。整个实验过程对小鼠死亡的小鼠做好跟踪记录，实验结果如图4所示。由图4可以看出，植入肿瘤对照组(ⅳ)的小鼠在两个星期小鼠全部死亡，而膀胱灌注氯胍能够显著降低含膀胱癌小鼠的死亡率，且0.75mmx50ul的剂量(ii)比0.20mmx50ul的剂量(iii)效果更好。对比例1一、实验材料氯胍购自sigma-aldrich公司；二甲双胍购自华润双鹤药业股份有限公司；n-(4-氟苯基)双胍：由自己制备，制备方法如下：将二甲双胍、无水乙腈加入125ml的圆底瓶中，冰浴冷却，缓慢加入碘化钠固体，搅拌，再滴加4-氟溴苄与无水乙腈的混合液，磁力搅拌，薄层色谱跟踪反应至二甲双胍反应完全，展开剂为二氯甲烷、甲醇、三乙胺的混合液，其中二氯甲烷、甲醇、三乙胺的体积比为4.3:0.7:3；室温放置24小时，过滤，滤液蒸干得油状物；将油状物采用100～200目的硅胶柱层析得n-(4-氟苯基)双胍粗品，流动相为体积比为900:100的二氯甲烷和甲醇的混合液；将n-(4-氟苯基)双胍粗品采用中压柱反相分离得n-(4-氟苯基)双胍纯品，产率为23.5％。流动相为体积比为98:2的水和乙腈的混合液。n-(4-氟苯基)双胍的表征如下：1hnmr(600mhz,dmso)δ7.34–7.29(m,2h),7.06–7.00(m,2h),5.19(s,4h),4.15(s,2h),2.79(s,6h).hrms[m+h]238.22。二、实验方法及结果取三份处于对数期的人膀胱癌细胞系umuc3，分别按照每孔7000个细胞进行种板，将接种完的培养板均放置于培养箱中过夜，然后将其中的一个培养板分别用0mm、0.5mm、1mm、2mm、4mm、8mm、10mm、20mm的二甲双胍处理，将其中的一个培养板分别用0μm、3.175μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm的氯胍处理，将其中的一个培养板分别用0μm、3.175μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm、100μm的n-(4-氟苯基)双胍处理，处理完后将培养板均放回培养箱中培养48小时，后用mtt比色法检测细胞生存率，并分别计算ic50值。实验结果如表1所示。ic50二甲双胍8.25mmn-(4-氟苯基)双胍36.45μm氯胍19.21μm表1。由表1中数据可知，氯胍ic50值低于n-(4-氟苯基)双胍的ic50值，并且显著低于二甲双胍的ic50值，因此，氯胍与n-(4-氟苯基)双胍和二甲双胍相比，具有更好的药效。对比例2一、实验材料ampk免疫测定试剂盒购自msk(默沙克)：二、实验方法及结果将人膀胱癌细胞系umuc3放入6孔板，在含有血清的培养基中孵育，直至细胞计数为约5×105；分别用二甲双胍、氯胍和n-(4-氟苯基)双胍处理umuc3细胞并以甲福明做对照处理umuc3细胞，反应24小时；然后通过ampk免疫测定试剂盒操作手册中所示的方法裂解细胞，通过蛋白质测定产生的细胞裂解物；通过ampk免疫测定试剂盒操作手册中所示的方法确定细胞裂解物中ampk的磷酸化水平，结果如表2所示。gic50(μm)甲福明2175二甲双胍＞200n-(4-氟苯基)双胍150氯胍2.9表2。由表2中数据可知，氯胍与n-(4-氟苯基)双胍和二甲双胍相比，其激活ampk能力更强。由实施例1～4和对比例1～2可知，本发明提供的氯胍在制备抗肿瘤药物中的应用，氯胍通过靶向肿瘤细胞能量代谢中的关键蛋白ampk发挥强大的抑癌效应，ampk的激活进而引发信号通路下游70s6k,4ebp1的下调，从而起到抑制肿瘤的效果；并且氯胍治疗肿瘤的效果强于n-(4-氟苯基)双胍、二甲双胍等其他双胍类药物。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12