靶向外泌体及制备方法、应用、药物递送系统和药物与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种靶向外泌体及制备方法、应用、药物递送系统和药物。

背景技术：

肿瘤转移是肿瘤死亡的重要原因。肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发部位向周围组织浸润，通过淋巴系统和血液系统向机体其他组织和器官扩散。这种扩散增加了患者的死亡率。肿瘤转移在临床上难以治愈的原因之一是药物难以到达转移部位。研究人员针对肿瘤特有的微环境以及肿瘤组织与正常组织的差异，设计了多种纳米载药系统来抑制肿瘤的转移。例如，靶向唾液酸低聚糖纳米载药系统，将p-3faxneu5ac加载到plga纳米颗粒中，显示出一定的抗小鼠黑色素瘤b16f10转移的潜力；或靶向叶酸受体的microrna纳米载体，以对抗结肠癌及其转移。这些纳米载药系统在一定程度上缓解了抗肿瘤转移制剂的缺乏，但仍存在一些不足：现有纳米制剂经常使用多种高分子材料，尽管这些高分子材料在某种程度上是良好的药物载体，但其非生物源性以及生物相容性和安全性方面的缺陷也成为限制其进入临床的重要因素。

针对上述缺陷，研究人员对药物载体的选择逐渐转向外泌体。外泌体是细胞分泌的具有双层脂膜结构的微囊泡。外泌体被由膜脂和膜蛋白组成的生物膜所包围，其结构和组成与细胞膜相似。外泌体的膜脂成分较细胞膜含有丰富的胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂和脂筏结构。外泌体能够将多种蛋白质、mrna、mirna等传递给相应的细胞或组织，参与并维持组织修复、免疫监视、凝血等许多正常生理功能。外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)转运效率高；(4)外泌体运载药物具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40～100nm之间，所以能够很好地利用增强渗透滞留(epr)效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。目前对于外泌体的表面修饰的研究报道均为利用重组质粒将靶向短肽和外泌体表面膜蛋白在外泌体分泌细胞上进行重组表达，通过收集释放的外泌体，达到对外泌体的表面修饰。利用该方法制备靶向肽存在转染效率较低的问题，难以实现大规模制备。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题在于如何提供一种有效提高外泌体修饰效率、从而能够实现大规模制备的靶向外泌体的制备方法、应用、药物递送系统和药物。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种靶向外泌体的制备方法，根据本发明的实施例，该靶向外泌体的制备方法包括以下步骤：

s1：对靶向抗体进行巯基化处理，得到巯基化靶向抗体；

s2：将巯基化靶向抗体与外泌体通过蛋白质交联剂连接。

根据本发明的实施例，该靶向外泌体的制备方法至少具有以下有益效果：

通过对靶向抗体进行巯基化修饰，使抗体上的氨基转变为巯基，随后将外泌体与巯基化靶向抗体交联结合，得到靶向外泌体。相比于现有技术中采用质粒转染方式进行修饰获得的靶向外泌体，克服了在质粒过程中存在的转染效率偏低、难以通过基因工程质粒转染进行大规模制备分泌母细胞的问题，能够实现靶向外泌体的工业化制备，对于外泌体作为递送载体和药物载体的研究和应用具有非常重要的意义。

另外，根据本发明的实施例，该靶向外泌体的制备方法还可以具有如下的附加技术特征：

在本发明的一些实施例中，利用2-亚氨基硫烷盐酸盐(traut′s试剂)进行巯基化处理。

在本发明的一些实施例中，s2包括以下步骤：

将外泌体与蛋白质交联剂反应，得到的产物与巯基化靶向抗体反应，得到靶向外泌体。

在本发明的一些实施例中，该靶向外泌体的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将靶向抗体与traut′s试剂室温反应后纯化得到巯基化靶向抗体；

(2)将外泌体与蛋白质交联剂室温反应后纯化得到外泌体中间产物；

(3)将巯基化靶向抗体和外泌体中间产物室温反应后用外泌体提取试剂盒提取得到靶向外泌体。

优选的，步骤(1)、(2)、(3)中的反应时间均为1h左右。

优选的，步骤(1)过pd-10柱纯化。

优选的，步骤(2)过nap-10柱纯化。

在本发明的一些实施例中，s2包括以下步骤：

对外泌体进行基团修饰，得到经修饰的外泌体；将巯基化靶向抗体和经修饰的外泌体通过蛋白质交联剂连接；基团修饰为巯基化修饰、氨基化修饰、马来酰亚胺基化修饰中的至少一种。

在本发明的一些实施例中，该靶向外泌体的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将靶向抗体与traut′s试剂室温反应后纯化得到巯基化靶向抗体；

(2)将外泌体与traut′s试剂室温反应后纯化得到巯基化修饰的外泌体；

(3)将巯基化靶向抗体和巯基化修饰的外泌体通过蛋白质交联剂连接。

在本发明的一些实施例中，蛋白质交联剂选自nhs-peg-mal、smcc、sulfo-smcc、lc-spdp、mbs等中的至少一种。其中，nhs-peg-mal是o-[n-(6-马来酰亚胺己酰)氨基乙基]-o′-[3-(n-琥珀酰亚氨氧基)-3-氧代丙基]聚乙二醇3000，smcc是4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，sulfo-smcc是4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，lc-spdp是琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸酯，mbs是3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯。

在本发明的一些实施例中，靶向抗体可以是肿瘤特异性表达的抗体或其它疾病的相关抗体。其中，作为肿瘤特异性表达的抗体的非限制性实例，可以是cd44、cd3、cd19、her2。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种靶向外泌体，根据本发明的实施例，该靶向外泌体采用上述任一项的制备方法制得。

根据本发明的第三个方面，本发明提供了一种靶向外泌体在制备药物递送系统、药物组合物中的应用。

根据本发明的第四个方面，本发明提供了一种药物递送系统，该药物递送系统包括作为递送载体的上述靶向外泌体。

在本发明的一些实施例中，药物递送系统为抗肿瘤药物递送系统。

在本发明的一些实施例中，药物递送系统还包括药物活性成分，具体可以是基因、蛋白质或其它药物活性成分。

根据本发明的第五个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括作为药物载体的上述靶向外泌体。

在本发明的一些实施例中，上述药物组合物为抗肿瘤药物组合物。

在本发明的一些实施例中，药物组合物还包括药物活性成分，具体可以是基因、蛋白质或其它药物活性成分。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的靶向外泌体的共聚焦显微镜结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。

实施例1：

一种靶向外泌体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将0.5mgcd44抗体与10μl的100nmtraut′s试剂以及10μl的5mg/ml的cy5-nhs室温反应1h后过pd-10柱纯化；

(2)将0.2mg外泌体与10μl的20mmnhs-peg-mal试剂室温反应1h后过pd-10柱纯化；

(3)在步骤(2)的产物中加入20μl的步骤(1)的产物，室温反应1h得到靶向外泌体。

实施例2：

靶向外泌体制备结果验证

将实施例1制得的靶向外泌体混悬液滴于共聚焦培养皿中(外泌体用绿色荧光染料gfp标记)，另外，实施例1中的靶向抗体已在制备时偶联有红色荧光染料cy5。通过共聚焦显微镜观察外泌体的荧光分布。结果见图1。图1是本发明的一个实施例的靶向外泌体的共聚焦显微镜结果图。如图1所示，图1中上排显示的外泌体混悬液中的外泌体聚合体的荧光分布，下排显示的是外泌体混悬液中的小型外泌体聚合体和单个外泌体的荧光分布；第一列显示的是外泌体的绿色荧光，第二列显示的是靶向外泌体上靶向抗体的红色荧光，第三列显示的是外泌体荧光图，第四列显示的是共聚焦显微镜merge(融合)图。

从图1中可以看出，无论是在外泌体聚合体或单个外泌体中，表征外泌体的绿色荧光和表征靶向抗体的红色荧光都可以很好地重叠在一起。该结果表明，靶向抗体在制备后较为均匀地连接到外泌体上，形成了非常均匀的靶向外泌体，通过本实施例提供的制备方法可以有效提高外泌体表面的修饰效率，从而实现靶向外泌体的工业化制备。

实施例3：

一种靶向外泌体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将0.5mgher2抗体与10μl的100nmtraut′s试剂室温反应1h后过pd-10柱纯化；

(2)将0.2mg外泌体与10μl的20mmnhs-peg-mal试剂室温反应1h后过nap-10柱纯化；

(3)在步骤(2)的产物中加入10μl的步骤(1)的产物，室温反应1h得到靶向外泌体。

实施例4：

一种靶向外泌体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将0.5mgcd19抗体与10μl的100nmtraut′s试剂室温反应1h后过pd-10柱纯化；

(2)将0.2mg外泌体与30μl的100nmtraut′s试剂室温反应1h后过nap-10柱纯化；

(3)将步骤(2)的产物中与步骤(1)的产物混合物加入mbs，室温反应1h得到靶向外泌体。

显然，以上所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。