双模式共轭聚合物纳米颗粒、其制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种双模式共轭聚合物纳米颗粒、其制备方法及其应用。

背景技术：

近几十年来，由病原菌感染引起的公共卫生与安全问题因其危及生命的后果而受到越来越多的关注。特别是自从几乎绝大多数耐抗生素药的超级细菌出现以来，人类健康面临着巨大的威胁。由于新抗生素开发要消耗时间和经济，因此探索简单、高效、快速的病原体杀灭系统是非常必要的。

在现有的抗菌策略中，光动力疗法作为光诱导治疗手段，以其高效、低毒、无创性和潜在的抗耐药能力，引起了人们极大的研究兴趣。光敏剂、氧气和光是光动力疗法中起抗菌作用的基本成分，在白光照射下，光敏剂能使氧气敏化产生活性氧以破坏细菌的完整性。然而，一些病原菌感染发生在缺氧的环境中或者在进行光动力治疗后，周围的氧气会因活性氧生成而减少，这严重影响了光动力治疗的抗菌效果。此外，由于白光对组织的穿透深度较差，可见光制约了光动力治疗在深部组织细菌感染治疗中的应用。

因此，为了提高光动力治疗材料的光治疗效率，将新模式纳入光动力治疗材料是一种可选择的策略。吸引科学界日益关注的光热疗法可将光能转化为热能，并已成功用于治疗癌症和微生物感染。大多数光热试剂在近红外区具有较强的吸收能力，同时有较强的穿透能力。因此，将光敏剂与光热试剂结合在一种材料中，有望有效对抗药性病原菌。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于提供一种双模式共轭聚合物纳米颗粒，该纳米颗粒可在近红外光和白光下实现光热治疗的光动力治疗，从而实现对病原体的高效杀伤。

有鉴于此，本申请提供了一种双模式共轭聚合物纳米颗粒，由具有式(ⅰ)结构的dppt-tt、具有式(ⅱ)结构的meh-ppv和具有式(ⅲ)结构的psma通过纳米沉淀法制备得到；

优选的，所述双模式共轭聚合物纳米颗粒的平均尺寸为50～60nm。

本申请还提供了一种双模式共轭聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

将如式(ⅰ)所示的dppt-tt的溶液、如式(ⅱ)所示的meh-ppv的溶液和如式(ⅲ)所示的psma的溶液在水中混合，得到混合液；

在所述混合液中通入惰性气体去除溶剂后升温，过滤后得到双模式共轭聚合物纳米颗粒；

优选的，所述dppt-tt和所述meh-ppv的质量比为1:(0.5～2)，所述meh-ppv和所述psma的质量比为1:(1～5)。

优选的，所述dppt-tt的溶液中的溶剂为四氢呋喃，所述meh-ppv的溶液中的溶剂为四氢呋喃，所述psma的溶液中的溶剂为四氢呋喃。

优选的，所述dppt-tt的溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml，所述meh-ppv的溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml，所述psma的溶液的浓度为1.8～2.3mg/ml。

优选的，步骤b)具体为：

向所述混合溶液中通入氮气，吹除溶剂；再升温至100～120℃继续通入氮气至混合溶液浓缩，冷却后过滤。

本申请还提供了所述的或所述的制备方法所制备的双模式共轭聚合物纳米颗粒在制备抗菌药物中的应用。

本申请还提供了一种抗菌制剂，包括所述的或所述的制备方法所制备的双模式共轭聚合物纳米颗粒和医学上可接受的辅料。

本发明提供了一种协同光热和光动力的双模式共轭聚合物纳米颗粒；其中，光热材料dppt-tt和光动力材料meh-ppv通过纳米沉淀法结合在一起，制备成双模式共轭聚合物纳米颗粒，进而使得本发明提供的纳米颗粒结合了光热治疗和光动力治疗的优点：同时具有高光热转换效率和优异的活性氧生成能力，具有极好的组织穿透能力来处理深部组织细菌感染，能避免由热扩散引起的对正常组织的损害，高效对抗耐药性细菌。因此，本申请提供的共轭聚合物纳米颗粒可作为抗菌药物治疗由耐药细菌诱导的感染。此外，本发明提供的制备方法简单且无需任何功能修改，合成收率高，易于实现工业化。

附图说明

图1为dmcpns的光热转换红外成像图和光热稳定性测定曲线图；

图2为dmcpns的活性氧生成曲线图；

图3为dmcpns与amp^re.coli作用的量热滴定曲线和zeta电位表征；

图4为dmcpns与amp^re.coli作用后的lb琼脂平板图；

图5为dmcpns与amp^re.coli作用后的扫描电子显微镜图；

图6为本发明实施例1制备的dmcpns纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱；

图7为本申请制备的dmcpns纳米颗粒的形貌照片。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

为了提高材料的抗菌性，本申请提供了一种联合光热和光动力治疗的双模式共轭聚合物纳米颗粒，该纳米颗粒可在近红外光和白光下实现光热治疗和光动力治疗，从而实现对病原菌的高效杀伤。具体的，本发明实施例公开了一种双模式共轭聚合物纳米颗粒，由具有式(ⅰ)结构的dppt-tt、具有式(ⅱ)结构的meh-ppv和具有式(ⅲ)结构的psma通过纳米沉淀法制备得到；

本申请提供的双模式共轭聚合物纳米颗粒是由dppt-tt、meh-ppv和psma经过纳米沉淀法制备得到。纳米沉淀法是通过控制两种溶液的混合来制备纳米颗粒的，其是有机溶剂中的疏水溶质与非溶剂混合时产生的局部过饱和，进而析出生成纳米颗粒的过程。

本申请所述双模式共轭聚合物纳米颗粒的平均尺寸为50～60nm；所述双模式共轭聚合物纳米颗粒中的psma为两亲性聚合物，其中的羧基分布于dppt-tt和meh-ppv形成的纳米颗粒表面(如图7所示)，而使得最终的纳米颗粒易在水中分散，有利于其抗菌性的发挥。

本发明进一步提供了所述双模式共轭聚合物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

将如式(ⅰ)所示的dppt-tt的溶液、如式(ⅱ)所示的meh-ppv的溶液和如式(ⅲ)所示的psma的溶液在水中混合，得到混合液；

在所述混合液中通入惰性气体去除溶剂后升温，过滤后得到双模式共轭聚合物纳米颗粒；

在上述制备双模式共轭聚合物纳米颗粒的过程中，本申请首先将式(ⅰ)所示的dppt-tt的溶液、如式(ⅱ)所示的meh-ppv的溶液和如式(ⅲ)所示的psma的溶液在水中混合，得到混合液；在此过程中，所述dppt-tt的溶液中的溶质为易与水互溶且易挥发的溶剂，在具体实施例中，所述溶质为二氢呋喃，所述meh-ppv的溶液中的溶剂为易与水互溶且易挥发的溶剂，在具体实施例中，所述溶质为四氢呋喃，所述psma的溶液中的溶剂为易与水互溶且易挥发的溶剂，在具体实施例中，所述溶质为四氢呋喃。所述dppt-tt的溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml，所述meh-ppv的溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml，所述psma的溶液的浓度为1.8～2.3mg/ml；在具体实施例中，所述dppt-tt的溶液的浓度为0.5mg/ml，所述meh-ppv的溶液的浓度为0.5mg/ml，所述psma的溶液的浓度为2.0mg/ml。所述dppt-tt和所述meh-ppv的质量比为1:(0.5～2)，在具体实施例中，所述质量比为1：1，所述meh-ppv和所述psma的质量比为1:(1～5)，在具体实施例中，所述质量比为1:4。

本申请然后在所述混合液中通入惰性气体去除溶剂后升温，过滤后得到双模式共轭聚合物纳米颗粒；上述是纳米沉淀法形成纳米颗粒的过程，所述惰性气体具体选自氮气。上述过程具体为：

向所述混合溶液中通入氮气，吹除溶剂；再升温至100～120℃继续通入氮气至混合溶液浓缩，冷却后过滤。

本申请还提供了上述双模式共轭聚合物纳米颗粒在制备抗菌药物中的应用。

同时，本发明还提供了一种抗菌制剂，其包括上述方案所述的双模式共轭聚合物纳米颗粒和医学上可接受的辅料。

本申请提供了一种协同光热和光动力的双模式共轭聚合物纳米颗粒，其中dppt-tt吸收近红外光之后从基态到激发态，然后再回到基态时能量以热量形式散出，使纳米颗粒具有高的光热转换效率；meh-ppv在白光激发下从基态到激发态，经过系间窜越到三线态，单线态回到基态时将能量转移到周围的氧分子，氧分子吸收能量之后产生活性氧物种，使纳米颗粒具有优异的活性氧生成能力；同时dppt-tt和meh-ppv吸收光谱波长较长，长波长光具有较好组织穿透能力，使得纳米颗粒具有极好的组织穿透能力来处理深部组织细菌感染；相比单独的dppt-tt制备的纳米粒子，双模式纳米颗粒的dppt-tt含量较低，不会由于过热引起感染周围的正常组织的损伤；从sem表征来看，纳米粒子对细菌的杀伤主要靠破膜，细菌对于热和活性氧引起的破膜很难产生耐药性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的双模式共轭聚合物纳米颗粒的制备方法及应用进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1采用纳米沉淀法制备dmcpns

分别取2mldppt-tt(0.5mg·ml^-1，thf)、200μl的meh-ppv(0.5mg·ml^-1，thf)、1mlpsma(2mg·ml^-1，thf)配成4ml的thf溶液，混匀后在超声下加入到10ml超纯水中，超声3～5min，得到均一透明的液体；

向最终获得的溶液中通氮气1h，吹除thf，升高温度到100℃，继续通氮气直至溶液浓缩至5ml，冷却至室温后溶液用0.22μm的水系滤膜过滤除杂，得到双目时共轭聚合物纳米颗粒(dmcpns)。

图6为上述制备的纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，平均粒径可达50.4±0.6nm，电势为-29.1±0.1mv。

实施例2对dmcpns进行光热性质表征

将100μldmcpns溶液置于200μl离心管中，用808nm激光照射5min，光强为550mw·cm^-2；近红外光激发的温度变化利用热成像仪(准确度为±0.1℃)检测并记录。

为了研究dmcpns的光热性能，在550mw·cm^-2的808nm激光器照射下监测dmcpns的温度升高值；如图1a和1b所示，dmcpns的温度仅在照射1min后从26.2℃显著快速增加到45.2℃，当照射5min时温度甚至达到62.4℃，这会对病原菌造成严重的光热伤害。因此，即使在相对短的照射时间下，dmcpns也显示出显著的光热效应，证实了它们快速和有效的光热转换能力。为了测试作为ptt中必不可少的dmcpns的光热稳定性这一评价参数，将样品在808nm激光下以550mw·cm^-2的光强照射5min，然后进行暗处理6min以使系统冷却至室温并且on/off循环重复5次(图1c)，由图可知，经过5个循环的on/off过程，dmcpns仍然具有与初始时一样的高光热响应，这进一步证实了dmcpns的高且极其稳定的光热性能。

实施例3对dmcpns进行光动力性质表征

还原态2,7-二氯荧光素(dcfh)的活化：取50μl10mm(4.8mg溶于1ml乙醇)的2,7-二氯荧光素二乙酸盐(dcfh-da)乙醇溶液加入450μl乙醇稀释，再加入2ml0.01mnaoh水溶液后室温避光放置30min活化，再加入10ml1×pbs(10mm，ph＝7.4)，将混合均匀后终浓度为40μm的dcfh溶液置于冰上待用。如下述反应式所示，在活性氧(ros)的存在下，dcfh会转化成高量子产率的2,7-二氯荧光素(dcf，激发488nm，发射524nm)，在石英比色皿中加入1ml活化后的dcfh溶液和100μldmcpns混合均匀后，将溶液在白光(0.5mw·cm^-2)下照射1min，每隔一分钟记录激发波长为488nm的dcf溶液在545nm的荧光发射光谱。空白组为未添加任何待测样品的活化dcfh溶液(40μm)，在相同的光照处理后，用同样的方法检测其荧光发射光谱。

为了进一步研究它们的光动力活性，我们研究了dmcpns和空白组在光照下使周围的氧敏化产生ros的能力。如图2所示，在dmcpns存在的情况下，dcf的荧光强度在0.5mw·cm^-2的白光照射下，随着照射时间的增加，dcf的荧光强度显著升高；对于不存在dmcpns的对照组，dcf的荧光无明显变化。以上结果表明，dmcpns具有较强的产热和ros生成能力，具有杀灭细菌的潜力。

实施例4

探究dmcpns与菌之间的相互作用，进行等温滴定微量量热法(itc)和zeta电位表征，具体步骤如下：

量热测量在modeltam2277-201微量量热系统(thermometricab，sweden)上进行，其中不锈钢样品池在25.00±0.01℃下为1ml，每条itc曲线重复至少两次，偏差在±4％以内；样品细胞最初加载660μlpbs或大肠杆菌pbs溶液(od600＝1.0)，然后将dmcpns溶液通过由612thermometriclund泵控制的500μlhamilton注射器以10μl连续注入搅拌样品中，直到相互作用进程完成；用金螺旋桨以60rpm搅拌该系统，从相应的观察到的表面活性剂与大肠杆菌的焓曲线中减去dmcpns的稀释焓，dmcpns和大肠杆菌的结合参数是通过将焓曲线与原始科学绘图软件v7.0.中提供的两组结合位点的模型拟合而获得的。

如图3a所示，减去dmcpns稀释焓的拟合itc曲线形状近似为s形，焓变(δhobs)从放热值逐渐变为零，表明dmcpns可以成功地与amp^re.coli结合并逐渐达到饱和状态。由itc数据计算的结合常数(ka)值为1.41×10⁵mol^-1，表明dmcpns与amp^re.coli之间的强烈相互作用；负δhobs值表明dmcpns与amp^re.coli之间的相互作用是焓驱动的。

为了进一步研究dmcpns与amp^re.coli之间的相互作用，进行了zeta电位表征以提供更多的见解；

将100μl(od600＝1)amp^re.coli与40μldmcpns混合，并用无菌1×pbs将终体积补充到500μl，37℃孵育30min，使细菌和dmcpns相互作用，离心(7100rpm，3min)将未与amp^re.coli作用的dmcpns去除，将沉淀得到的细菌重悬于1ml超纯水中，置于冰上用于细菌表面zeta电势的测量实验；对照实验分别为不做任何给药处理，amp^re.coli与40μldmcpns悬浮于1ml超纯水经过相同孵育、离心和重悬等实验。

图3b显示未经处理的amp^re.coli具有-51.1±0.3mv的zeta电位，用9.6×10^-4μmdmcpns孵育后的amp^re.coli变为-49.1±0.3mv；可以得出结论，在dmcpns作用之前和之后，amp^re.coli的zeta电位没有明显变化；通过itc和zeta电位的表征，我们提供了更多证据证明dmcpns与amp^re.coli之间存在强烈的相互作用。

实施例5

dmcpns的抗amp^re.coli实验，具体步骤如下：

将lb固体培养基上带有氨苄青霉素抗性的e.coli(top10)单克隆菌落转移到10mllb液体培养基(含有50μg·ml^-1氨苄青霉素)，并在37℃下180rpm震荡培养6～8h；取2mle.coli菌液，通过离心(7100rpm，3min)沉淀细菌，沉淀用无菌1×pbs(10mm，ph＝7.4)洗涤两次后，弃去上清液，将剩余的e.coli重悬于1×pbs中，稀释至在600nm处光密度为1.0(od600＝1)。

在40μldmcpns中加入100μlamp^re.coli(od600＝1.0)，并用pbs将菌液终体积补充到500μl，在暗处37℃下作用30min；从500μl溶液中分别取100μl在近红外光(550mw·cm^-2)下照射5min；在白光(65mw·cm^-2)下照射5min；在近红外光(550mw·cm^-2)下照射5min后紧接着在白光(65mw·cm^-2)下照射5min，然后用pbs稀释1×10⁴倍；取100μl稀释后的菌液涂于lb培养基上，37℃培养16～18h后形成统计菌斑形成个数；对照组的照射条件为避光，实验组的照射条件为近红外光照射、白光照射、近红外光联合白光照射；固体培养基培养规格为90mm。根据以下公式计算amp^re.coli抑菌率ir：

ir＝(c0-c)/c0×100％

其中c为实验组的克隆形成单位数(cfu)，c0为对照组克隆形成单位数。

可以算出对应30μldmcpns的浓度为9.6×10^-4μm。

如图4所示，在lb琼脂平板上拍摄amp^re.coli的照片，直接观察在dmcpns存在或不存在下用不同光照射条件处理的amp^re.coli生长量。在近红外光联合白光照射下，存活的amp^re.coli远少于在nir光或单独的白光照射下存活的amp^re.coli，这意味着ptt和pdt的协同效应。值得注意的是，未经dmcpns处理的amp^re.coli大部分可以在近红外光，白光和近红外光联合白光照射下存活并形成菌落，这表明在这些光照射条件下细菌不会受到影响。

为深入了解dmcpns的抗菌机制，采用扫描电子显微镜(sem)观察了amp^re.coli在不同光照条件下与dmcpns作用前后的形态变化。图5显示，在nir光，白光和近红外光联合白光照射下，未经dmcpns处理的对照组中的amp^re.coli表面显示完整的形态，这证实近红外光或白光本身对amp^re.coli没有破坏作用，这一点与抗菌实验的结果一样。相反，对于用9.6×10^-4μmdmcpns孵育的组，在黑暗下amp^re.coli表面有一些小孔；在nir光照射下部分amp^re.coli体积变小，表面出现较多孔洞；在白光照射下amp^re.coli表面发生塌陷并有分裂融合的趋势；在近红外+白光照射下(如图中黄色箭头所示)，amp^re.coli变得更小，伴随着更严重的塌陷和凹陷。sem表征的结果与抗菌实验结果基本一致，进一步说明在ptt和pdt联合作用下，dmcpns对细菌具有明显的损伤作用。

综上，本发明制备了结合光热治疗和光动力的双模式抗菌共轭聚合物纳米粒子可有效地进行抗菌应用。双模式抗菌共轭聚合物纳米粒子同时具有高光热转换效率和优异的ros生成能力。抗菌实验表明，在近红外光(550mw·cm^-2,5min)和白光(65mw·cm^-2,5min)的组合下，9.6×10^-4μm的dmcpns对amp^re.coli的抑制率为93％。itc和zeta电位测量证实双模式抗菌共轭聚合物纳米粒子表面上的羧酸基团和细菌之间存在强烈的非特异性相互作用。dmcpns结合了ptt和pdt的优点，不仅提供了极好的组织穿透能力来应对深部组织细菌感染，而且还避免了由热扩散引起的对正常组织的损害。重要的是，dmcpns易于制备而无需任何功能修改。在治疗由耐药细菌诱导的感染方面存在潜在的有价值的应用。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。