miRNA125b纳米粒子的应用的制作方法

本发明涉及的mirna125b纳米粒子领域，具体涉及mirna125b纳米粒子的应用。
背景技术：
：皮肤是脊椎动物最容易被观察到的重要表型特征，人类皮肤可呈红黄棕及黑色，这主要与色素的沉着程度有关，黑色素细胞可合成黑色素,将其分泌到皮肤角质细胞中,与肤色及毛发调控密切相关。黑色素最重要作用是可以吸收紫外线,保护肌肤免受光老化、皮肤炎症和皮肤癌的侵害。黑色素细胞的代谢若是受到破坏或抑制，会产生一些疾病，例如遗传疾病白化症，黑色素细胞瘤等，据了解，在皮肤肿瘤中,约有80％的死亡是由黑色素瘤造成。此外黑痣、雀斑等皮肤上的斑点，也都与黑色素细胞有关。综上所述，黑色素细胞的研究有利于理解和掌握产生黑色素机制和它的调节，在美容和化妆品领域可以制造新的美白产品，在医学领域可以治疗白化病，白癜风，黑毒肿等疾病，而且黑色素有很大应用潜力,如用作化妆品或染发剂装饰、清除自由基、生物杀虫剂光保护等。黑色素可用于病毒性疾病的预防和治疗,可溶性黑色素在体外对hiv病毒有显著抑制作用,还可抗流感病毒诱导细胞凋亡.这些都与我们的生活息息相关。已知microrna是皮肤生理学的重要调节剂并且被认为是治疗皮肤疾病的新治疗靶标。mir-125b被确定为稳态黑素生成的有效调节剂。技术实现要素：本发明提供了一种mirna125b纳米粒子的用途。本发明的mirna125b纳米粒子的应用，将浓度为5～20ug/ml的mirna125b纳米粒子与黑色素细胞培养24～48h，用于抑制黑色素细胞增值。本发明包含以下有益效果：本发明针对mir-125b对小鼠黑色素细胞黑色素的合成具有抑制作用，并初步探索其分子机制，为哺乳动物毛色形成的分子网络提供理论依据。本发明发现mir-125b的表达与色素水平呈负相关,mir-125b模拟物可降低色素沉着相关基因和黑色素含量的表达，这意味着mir-125b可减少色素沉着。本发明旨在探究mir-125b对黑色素细胞产生黑色素调控的具体机制以及验证对黑色素生成的抑制作用。近年来，已经有一些调控黑色素生成的mirna调控黑色素的生成网络正在逐渐形成，进一步研究黑色素沉积的分子机制，利用mirna定向改变毛色以及将mirna应用于美容行业将会成为未来研究mirna调控色素沉积的新方向。附图说明图1为实施例1的5μg/mlmir-125-b纳米粒子作用48h在黑色素细胞内表达图；图2为phy-502载体质粒图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的mirna125b纳米粒子的应用，将浓度为5～20ug/ml的mirna125b纳米粒子与黑色素细胞培养24～48h，用于抑制黑色素细胞增值。本实施方式所述的黑色素细胞为melan-a小鼠黑色素细胞，购买自上海沪震生物科技有限公司。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：mirna125b纳米粒子的浓度为10～15ug/ml。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：mirna125b纳米粒子的浓度为12～18ug/ml。其它与具体实施方式一相同具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：培养时间为32～48h。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的培养24～48h，是在96孔板中进行的。其它与具体实施方式一相同。本
发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。通过以下实施例验证本发明的有益效果：实施例1mirna125b纳米粒子对黑色素细胞的功能验证：一、mirna125b纳米粒子的构建；1载体的双酶切取含phy-502载体质粒(购买得到，质粒如图2所示)的菌液过夜培养，并取新鲜菌液3-5ml提取质粒。2.取1μg新鲜质粒，用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切体系如下：于37℃酶切约3h。1)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行胶回收，步骤如下：在、紫外灯下，切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg＝100μl来计算凝胶的体积，并加入3倍凝胶体积的qgbuffer置于50℃水浴锅内将凝胶彻底融化。期间适当摇晃ep管，加快凝胶的溶解。2)凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。3)将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。(可重复一次)然后弃掉管内液体，向柱内加入750μl的pebuffer。离心1min。弃掉管内液体，再次空离2min。换一个新的1.5ml的ep管，向柱子内加入20μl的ddh2o，离心1min。为了提高回收率，可将溶解的dna再次加入柱子内离心一分钟。弃掉柱子，即为回收的载体片段，并测定浓度。3.目的片段的扩增及酶切(1)将合成的引物稀释成终浓度为10μmol/l的储藏液。(2)利用稀释的引物及客户提供的模板进行pcr扩增。体系如下：模板1-2μg引物12μl引物22μlpcrmix25μlddh2o补足50μl将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入pcr仪内，选择好合适的退火温度和延伸温度，即可开始pcr扩增。(3)pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。方法同上。(4)将回收后的目的基因进行双酶切，酶切体系如下：于37℃酶切约5h或者过夜。(5)将酶切产物进行琼脂糖电泳并回收目的片段，方法同上。4.过表达载体与目的片段的连接(1)测定回收载体和目的片段的浓度，并按载体：目的片段＝1:7的摩尔比例计算载体和目的片段所需的体积比。(2)过表达载体与目的片段的连接，连接体系如下：回收载体160ng目的片段80ng5×ceentrybuffer4μlexnaseentry2μlddh2o补足20μl于37℃连接30min后，立即置于5℃冰水浴冷却。5.转化(1)将感受态细胞置于冰上(4℃)待其自然解冻后，取10μl连接产物加入感受态细胞中于冰上(4℃)放置30min。(2)之后于42℃水浴中热击90s。然后迅速置于冰上(4℃)放置2-3min。(3)加入500μl不含抗生素的soc培养基于37℃，225rpm振荡培养45min。(4)3000rpm离心2min，弃掉900μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有载体上对应抗性(氨苄或卡那等)的培养平板中，用灭菌的涂布器涂匀(涂布器的温度不能太高，以免烫死菌体)，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。6.pcr鉴定(1)挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。(2)进行菌液pcr初步鉴定，方法同上步骤3，只将模板替换成新鲜菌液2-3μl。(3)将初步鉴定为阳性的样品，每个克隆挑选两个送测序公司进行测序鉴定。①黑色素细胞的分离培养；a.取下出生3-5d的小鼠背部的皮肤组织消毒，剪成1×2mm2的小块，用2.5g/l的dispase2酶4℃过夜消化后将表皮置于2.5g/l的胰酶中室温消化，过滤离心，弃上清，加入黑色素细胞培养液(购买自上海中乔新舟生物科技有限公司)。b.细胞接种4h后，可见细胞贴壁生长，原代细胞培养10d后即可传代。②黑色素细胞培养用dmem+10％小牛血清37℃、5％co2培养箱中培养；24h后换液；细胞生长至80％—90％发生融合时进行传代。③mirna125b纳米粒子对黑色素合成的影响；a、mirna125b纳米粒子对黑色素细胞毒性取体外培养的黑色素细胞，96孔板培养24h，48h，mts法测毒性，计算最大无毒浓度。b、mirna125b在黑色素细胞中表达、积累、分布的检测egfp标记的mirna125b纳米粒子，加入体外培养的黑色素细胞培养体系中，在激光共聚焦显微镜下检测mirna125b48h在细胞内累积情况，结果见图1所示。由图1可知，在激光共聚焦显微镜下细胞内有egfp标记的mir-125b纳米粒子发出的绿色荧光，代表mir-125b纳米粒子在细胞内表达。c、黑色素抑制率检测；取体外培养的黑色素细胞，6孔板培养加mirna125b纳米粒子培养48h，pbs冲洗3次,加入裂解液100μl30min，高速离心，上层蛋白测定蛋白浓度，细胞沉淀加(1mol/l)naoh(含10％dmso),80℃水浴1h溶解黑色素,配置人造黑素标准溶液,在405nm波长下检测吸光值。结果如下：由此表可知，在20ug/ml条件下，抑制效果最佳。d、酪氨酸酶相对活性检测取体外培养的黑色素细胞，6孔板培养加药培养48h，pbs冲洗3次,加入裂解液100μl30min，高速离心，取上层90μl加10μl0.1％左旋多巴溶液避光37℃30min，酶标仪测490nm吸光度。结果如下：由此表可知，在5ug/ml条件下，抑制效果最佳。统计学方法mirna125b作用靶点分析。靶基因预测软件分析mirna125b的作用靶点，通过wb与rt-pcr验证靶蛋白的变化。④动物实验验证mirna125b纳米粒子减低黑色素的药效取c57bl6j小鼠，背部皮肤表面涂抹egfp标记的纳米粒子两周，活体在曝光机下观测纳米粒子荧光分布，取皮肤组织做病理看纳米粒子毒副作用，测黑色素含量，酪氨酸酶相对活性。其中，小鼠皮肤黑色素含量抑制率：在施用5ug/mlmirna125b纳米粒子后，抑制率达到24.84％。小鼠皮肤酪氨酸酶相对活性：在施用5ug/mlmirna125b纳米粒子后，相对活性达到86.57％。序列表<110>佳木斯大学<120>mirna125b纳米粒子的应用<160>1<210>1<211>629<212>dna<213>phy-502载体。gtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaag60ctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgcc120atcgcctccggctccgccttgccctgactcgagtcgtgattactcagctcatcctaactt180ttatatatcatatatatttctactgaagtattttaaatagtatttagaggtaaaagtcta240agtgaacccaactgtaatttctaagctatccttatttctggaagaagaattctaccgcat300caaaccagacttttcctagtccctgagaccctaacttgtgaggtattttagtaacatcac360aagtcaggctcttgggacctaggcggaggggaaccagcagctttggaccttattgattgt420ctgcagttaccaccagaacaaaagaacatacatagattctgcctaggagaaaagaacaat480gcttttctttatcatcagcaacgttttcaccatgacccatccccaaaaggatcctattaa540ttaataattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgcttt600agcagccccgctgggcactggcgctacac629当前第1页12