白细胞介素-10的哺乳动物受体的制作方法

专利名称：白细胞介素-10的哺乳动物受体的制作方法
技术领域：
本发明普遍涉及哺乳动物白细胞介素-10受体特有的核酸和多肽，以及特别是它们在制备用于诊断或治疗各种受体相关医学状态的试剂中的应用。
活化的造血细胞分泌大量蛋白质，其中一些被称作细胞因子。细胞因子通过控制增生作用、分化作用以及免疫细胞的效应物功能而在免疫应答调节中起着多种重要作用。
细胞因子的作用典型地是由在靶细胞上发现的特定受体分子所介导的。靶细胞上的这些受体的结构和作用机理不十分清楚，虽然已知其大多由至少两个分离的多肽链构成。
其中一条链通常以α链表示，能够与它的细胞因子配体以低亲合力结合。这种相互作用可以或不可以导致信号转导到细胞中。另一条链以β链表示，当与α链联合时，它赋予异种二聚体受体与细胞因子结合的高亲和力。β链本身通常没有明显的配体结合亲和力。受体的二聚体形式与配体(如细胞因子)结合的结果是能将信号传导至细胞中。
抑制其它多种细胞因子合成的一种细胞因子被称为白细胞介素-10(IL-10)。参见Fiorentino等，J.Exptl.Med.1702081(1989);和Mosmann等，Immunol.Today 12A49-A53(1991)。小鼠和人的对应物已被分离。见Moore等，Science 2481230(1990);以及Vieira，等，Proc Nat′l Acad.Sci.USA 881172(1991)。
已描述过被称为vIL-10或BCRF1的人病毒类似物，它具有许多天然人形式的特征性活性。见Hsu等，Science 250830(1990)。已经由马疱疹病毒中发现另外的病毒类似物。见Rode等，Viral Genes 7111(1993)。
由于IL-10的生物重要性，并且由于IL-10首先与细胞受体结合而起作用，因此需要这种受体的分离成分，以及需要制备和使用这些成分的材料和方法。
本发明通过提供IL-10受体成分的核酸和蛋白质序列满足了这一需要。以人IL-10受体成分和小鼠对应物两者作为例子，虽然用相似方法或以其其它性质为基础将会发现其它哺乳动物种类的相应成分。
更确切地说，本发明提供了由具有与编码哺乳动物IL-10受体、其片段或其特定部分序列同源的序列构成的重组或分离的核酸。在优选的实施方案中，核酸将包括被分离的脱氧核糖核酸，进一步包括来自与编码IL-10受体基因毗连的5′或3′序列的调节序列，或者核酸与遗传控制单元操作连结。在另一种实施方案中，受体、片段或其一部分具有生物活性，例如具有IL-10受体的一个特征，或者是来自哺乳动物，包括鼠和人。
在特定实施方案中，核酸能以高严谨度与序列SEQ ID NO1或3杂交，或者用探针分离，此探针以高严谨度与人IL-10受体基因杂交。本发明还包括能与例如含有选自下组包括的核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸段转换的突变体的这些序列杂交的核酸。另一种实施方案包括与遗传控制单元，例如，原核启动子元件或真核表达控制单元，包括病毒启动子操作连接的重组核酸。
不同实施方案包括表达编码IL-10受体或其片段的DNA的表达载体，或包括这些序列和一个选择标记的载体。本发明还包括含有能表达这些受体的表达载体的宿主细胞。优选的宿主细胞实例包括原核生物，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，包括大肠杆菌;低级真核细胞包括酵母;高级真核细胞包括动物细胞如哺乳动物和灵长目动物细胞，包括人。最好受体选自人IL-10受体，或鼠IL-10受体。另外的实施方案包括进一步编码第二种蛋白质或多肽的核酸，例如，第二种多肽与所述受体或其一个片段融合。本发明还包括含有这些核酸的亚细胞结构、细胞，或含有这些核酸的生物。
本发明还包括由这些DNA序列编码的蛋白质或多肽，最好基本上不含不是由重组宿主中产生的蛋白质或细胞污染物。受体蛋白质或多肽通常由哺乳动物体得到，包括鼠或人，具有所示SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，或其等位序列或其变种，或其一个特定部分。受体蛋白质或多肽能与一个固体支持物相连，可以基本上是纯的或药学上可接受的形式，有或没有另外的载体或赋形剂。本发明也涉及融合蛋白质或多肽，包括那些进一步含有来自第二种受体蛋白质的一段序列的融合蛋白或多肽。其它实施方案包括亚细胞结构、细胞或含有这种受体蛋白质或多肽的生物。
本发明还提供了在营养基质中培养含有所述核酸的细胞以制备受体蛋白质或多肽的方法，以及在细胞中表达该受体蛋白质或多肽的方法。各种可选择的实施方案还包括纯化受体蛋白质或多肽的步骤，其中把受体蛋白质或多肽分泌到培养基中并从那里纯化，且其中由哺乳动物，包括鼠和人体内得到受体。本发明还提供了由这些方法制备的受体，并且显示了不同于正常天然受体的转译后修饰模式，例如，糖基化;烷基化;和羧基化。受体可在表达显示非天然受体糖基化模式的受体的细胞系中制得。本发明还提供了诊断以宿主中不适当IL-10应答为特征的医学状态的方法，包括使得自具有特异性结合剂的宿主的样品与(ⅰ)编码IL-10受体或其片段的核酸接触;或与(ⅱ)IL-10受体或其片段相接触，并测定试剂与样品结合的程度。在各种可选择的情况中，结合剂是编码受体或其片段的一种基因的核酸探针，识别IL-10受体或其片段的一种抗体;或IL-10受体的一个配体，拮抗剂，或抗拮抗剂。最好受体由哺乳动物，包括鼠和人体中得到。
本发明还提供了筛选对于IL-10受体有结合亲和力的化合物的方法，包括用所述方法制备分离的或重组的受体;并检测化合物与该受体的结合，因而鉴定具有确定结合亲和力的化合物。最好该化合物是这些受体的一种配体，拮抗剂，或抗拮抗剂。
本发明也提供了蛋白质和多肽，例如自然配对的具有与IL-10受体片段同源性氨基酸序列的游离蛋白质。典型的情况是，受体由哺乳动物获得，包括鼠或人，而且特定实施例具有SEQ ID NO2或4序列。
本发明涉及重组体或基本上纯的蛋白质，包括与IL-10受体氨基酸序列显示出实质同一性的区域。特别实施例包括具有选自SEQ ID NO2或4序列的多肽，或连接到固体支持物上的多肽。
本发明提供了对于IL-10的重组受体或其片段来说具有结合亲和力的多种抗体。优选实施例例举了抗IL-10受体，可以是中和或非中和抗体，与有毒部分融合，或者与包括放射性核素的标识部分接合。同时也提供了象Fab和FV的结合片段。抗体或片段最好是结合到包括鼠或人哺乳动物的受体上。
另外，本发明提供了治疗具有以不适当IL-10应答或呈现IL-10受体异常表达为特征的医学状态的患者的方法，包括给患者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括(a)与IL-10的受体或其片段结合的抗体;(b)IL-10受体的配体、兴奋剂或拮抗剂;或(c)结合IL-10受体或其片段的配体。在一实施例中，所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另外一些实施例中，使靶化合物与(a)IL-10的分离的或重组的受体，或(b)结合该受体片段的配体接触，并用分离的或重组IL-10受体，或结合该受体片段的配体鉴定靶化合物，并鉴定靶化合物的接触效果，用这种方法来选择兴奋剂或拮抗剂。
本发明也提供了估评试验化合物与IL-10受体的结合亲和力的方法，该方法包括接触(a)含有受体或其片段的样品;与具有已知该受体亲和力的标记化合物，和(b)试验化合物;并测定被结合的标记化合物的含量，此量与被结合到受体上的试验化合物的量成反比。最好，该受体由哺乳动物，包括鼠或人中得到。另一可选择实施例是调控IL-10受体的生物活性的方法，包括使受体与选自与该受体结合的抗体;IL-10受体的配体，兴奋剂或拮抗剂;结合有IL-10受体片段的配体的组合物接触。
本发明也提供了药盒形式的应用试剂。例如，提供了用于(a)确定IL-10受体的数量;或(b)测定试验化合物对IL-10受体的结合亲和力的药盒，该药盒包括具有该受体结合亲和力的标记化合物，和测量被结合标记的化合物的工具。
各种实施例包括的药盒进一步还含有重组体受体，其中所标记的化合物是受体的配体，包括IL-10;其中该化合物是抗体;其中测量工具是固定该受体的固相;或其中该固相含有捕获分子。本发明也提供了检定样品中抗IL-10受体的抗体的药盒，包括该受体和抗体测定工具。在一实施例中，该受体与固体支持物相接触。本发明还提供了含有用在检定中的DNA探针例如人IL-10mRNA的药盒。
本发明还提供了已知调控IL-10受体活性的化合物，用下面的方法选择用IL-10的分离的或重组体受体或其片段接触该化合物;由这种接触评估对生物活性的影响。
本发明还提供了调控IL-10生物作用的方法，包括干扰生物机制的步骤例如对二类细胞因子受体(例如干扰素受体)的信号转导进行干扰。也提供了调控二类受体例如干扰素的生物作用的方法，包括干扰IL-10受体的生物机制这一步骤。
本文所引用的全部参考文献特此被完全并入本文作参考。
本发明涉及哺乳动物IL-10受体亚单位的氨基酸和DNA序列，例如人和鼠IL-10受体亚单位。这些序列由含有特异性结合IL-10的cDNA表达库产物的细胞筛选库得到。这样得到的受体-配体复合物被化学交联，多种方法被用来分离编码结合蛋白质的核酸。
该重组核酸和被分离或被纯化的核酸是与编码IL-10受体亚单位的序列或其片段基本上同源的。本发明还涉及编码融合多肽的核酸，以及含有这种核酸的载体、转化的宿主细胞，和生物体。由该核酸衍生的重组体和分离的或纯化的IL-10受体亚单位或其片段也是本发明的一部分。
本发明也提供了与位于受体亚单位表面的抗原决定簇具有特异性的抗体，包括特异性结合普遍存在于表面上的抗原决定簇，或结合一种受体所特有的抗原决定簇的抗体。
本发明包括含有这些材料的药盒。药盒中的各种核酸、多肽和抗体能用于多种诊断中治疗目的。
这些材料能用于治疗哺乳动物的方法中，特别是那些具有不期望的受体功能的哺乳动物，这些疾病例如自身免疫疾病、二类细胞T辅助的不适当免疫应答、Ⅱ类MHC的不适当功能、被抑制的单核细胞或巨噬细胞相关的免疫功能、脓毒性或毒性休克反应和细胞内病原体介导的疾病。这些方法包括施用有效量的这些物质，或用这些物质接触生物样品。
本发明物质还能用来选择和筛选对受体有特异性的拮抗剂和兴奋剂。例如能制备缺少细胞质和/或跨膜区域的可溶解形式的受体亚单位，并用标准方法固定在固体支持物上，用于特异性结合受体。因此能鉴定特异性结合至细胞外结合点或IL-10受体细胞内区域的配体。其中特别的应用是影响IL-10受体所归属的类的多受体类型，即二类受体类型的配体。在下文中更全面地描述二类受体。
可以制备特异性结合至配体识别部分或受体其它部分的抗体。受体亚单位或其片段或具有所述亚单元序列的相应序列的合成多肽可用作制备这种抗体的一般方法中的抗原。
下面的描述主要涉及鼠或者人IL-10受体，但包括结构或生物活性的很多性质将适于这两者以及其它哺乳动物的对应物例如兔、猪、绵羊和山羊等。因此由其它种得到的类似用途和材料能按这里所描述的方法获得。这样，其它种可以包括其它温血种象鸟类或灵长目动物。
这里所使用的标准方法，例如描述在Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor PressWu et al.，(eds)，1989，“Recombinant DNA Methodology”from Methods in Enzymology，Academic Press，NY;Sambrook et al.，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，(2D ed.)，vols 1-3，CSH Press，NY;Ausubel et al.，Biology，Greene Publishing Associated，Brooklyn，NY;或Ausubel et al.，1987 and Supplements.Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York。
为得到编码IL-10受体亚单位的核酸，用由应答IL-10的细胞分离出的信使RNA(mRNA)构建互补DNA(cDNA)库。用命名为BJAB的AB细胞系制备源于人的cDNA库，分别以MC/9和J774表示的肥大细胞和巨噬细胞细胞系用于制备源鼠的cDNA。
用几种改变和独特技术通过表达克隆克服与分离cDNA克隆相关的问题。特别是需要鉴定适宜的细胞系，其中编码所需IL-10结合活性的cDNA库能被制备。确定IL-10是否能与克隆分离的表达产物结合，以及选择具有低背景IL-10结合活性的细胞系用于表达是重要的。
通过加入提供测定配体-受体交联复合物手段的N-末端延伸部分来修饰用作配体的IL-10(下文中“IL-10”和“配体”一词可以互换使用)。所用延伸部分是被一种抗体特异性识别的FLAG肽，虽然也可以用其它延伸部分来代替。见Hopp et al.，Bio/Technology 61204(1988)。不知道所述延伸部分是否与配体-受体互相作用干扰，或所观察到的任何IL-10结合蛋白质相互作用是否在生理上恰当的。
通过使用这种延伸部分，能测定表达受体成分的细胞，以及在其表面具有交联复合体的亲和性固定细胞。这两种方法被用于丰富和验证IL-10受体亚单位的特性。
制备鼠和人细胞受体亚单位cDNAs后，将其测序。
本发明涉及实际上被测序的非糖基化受体亚单位，该蛋白质的等位变异体和各种代谢变异体，例如同不同细胞类型产生的转译后修饰作用，包括用在重组体表达系统中的天然细胞和宿主细胞。通过选择适当的细胞源能够制备各种糖基化变异体和转译后修饰变异体。
分别用SEQ ID NOs1和2来定义完全的人IL-10受体亚单位(IL-10R)核苷酸序列和被推测的氨基酸序列。鼠核苷酸序列和从中所推测的氨基酸序列分别用SEQ ID NOs3和4来定义。SEQ ID NO3中的起始密码子由碱基61开始。
由以SW8.1表示的克隆中得到人序列，SW8.1在一质粒中于1992年12月4日保藏于American Type Culture Collection，Rockville，MD(ATCC)，且登记保藏号为ATCC69146。疏水膜距片段显示与人受体成分的氨基酸217～243相对应。因此，可溶性结合片段对应于来自大约残基1～216或更短的一个延伸部分。
由以pMR29命名的克隆得到鼠序列，pMR29在一质粒中，于1992年12月4日保藏于ATCC，且登记保藏号为ATCC69147。
这里所使用的术语“IL-10受体亚单位”意指包括用SEQ ID NO2或4定义的或用以SEQ ID NO1或3定义的核酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质或肽。这个术语也指特异性结合IL-10的这类蛋白质或多肽的片段。这类片段可通过蛋白水解裂解、化学合成或重组方法来制备。
本发明的一些IL-10受体亚单位以高亲和力结合到IL-10上，象人或鼠的IL-10，高亲和力例如至少大约10nM，通常高于3nM，优选高于1nM，更优选的高于0.5nM。当额外的蛋白质成分与这里所公开的成分例如类α链相联系时，期望多蛋白复合体与其配体的结合亲和力将增大。
本发明还包括具有与本文所定义的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列的蛋白质或肽，但除外显示与确知的G-CSF、GM-CSF、EPO、TNF、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6或IL-7受体亚单位序列同源性相同或较少的氨基酸序列同源性的任何蛋白质或肽。
一些肽不结合IL-10，但可以结合涉及信号转导或其它与受体相互作用的迄今未鉴定的细胞内分子。这些肽具有相应于受体细胞内或跨膜结构域的氨基酸序列。
本发明还提供了未知结合能力的其它肽。由于它们具有相应于部分受体分子的氨基酸序列，因此这些肽可用作例如制备抗体的抗原。
通过优化残基匹配，如果需要，通过引入需要的空隙来测定氨基酸序列同源性，或序列同一性。考虑到匹配时取代基的转化，上述情况可以有不同变化。转化的取代基有代表性地包括下组范围内的取代基[甘氨酸，丙氨酸];[缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸];[天冬氨酸，谷氨酸];[天冬酰胺，谷氨酰胺];[丝氨酸，苏氨酸];[赖氨酸，精氨酸]和[苯丙氨酸，酪氨酸]。同源的氨基酸序列趋于包括每个受体序列的天然等位变异体和种间变异体。
典型的同源性蛋白质或多肽与本文所定义的氨基酸序列相比具有25～100%同源性(如果引入空隙)，至50～100%同源性(如果转化取代基被包括在内)。同源性检测为至少大约50%，一般至少56%，较一般至少62%，经常至少67%，较经常至少72%，典型地至少77%，较典型地至少82%，通常至少86%，较通常至少90%，最好至少93%，更优选至少96%，在特别优选实施方案中，至少98%或更多。一些同源的蛋白质或多肽，象各种受体亚型，与IL-10受体成分共有多种生物活性;例如用于陈述本发明的有关实施例。
这里所使用的术语“生物活性”没有限定地定义为包括结合配体(例如类IL-10蛋白质)、与抗每个受体组分的抗体的交叉反应性和配体依赖的信号转导。“配体相关活性”是指或者配体自身结合，或者以配体结合所介导的生物活性，包括例如第二信使调制，Ca++吸收，磷酸化作用，蛋白质结合等。
术语“配体”是指通常是类细胞因子肽家族成员的分子，其通过涉及肽配体结合的片段与受体结合。配体也是作为或者所述受体结合的天然配体，或是其类似物的分子，或者是天然配体的功能类似物的分子。该功能类似物可以是结构改变的配体或者可以是完全不相关的分子，该分子具有与适宜配体结合决定域相互作用的分子形状。这些配体可以作为兴奋剂或拮抗剂，参见例如Goodman等，(eds)，Goodman and Gilman′sThe Pharmacological Bases of Therapeutics(8th ed)，1990，Pergamon Press。
特别有用的溶解性受体亚单位片段可结合IL-10配体。因为完整的受体显示含有配体与之结合的细胞外区域，由残基217～243跨膜螺旋片段的氨基近端细胞外碎片构成的蛋白质将显示如此的结合活性。很容易检测细胞外区与其它蛋白质和较短片段融合的配体结合活性。由细胞内区构成的片段也可以应用。
人和鼠IL-10受体亚单位在DNA和蛋白质序列水平上显示出70～75%同源性。在明显结构基序的基础上，IL-10受体亚单位属于细胞因子受体超家族的二类组中的一员。参见例如Bazan，Immunology Today 11350(1990);和Bazan，Proc.Nat′l Acad.Sci USA876934(1990)。
一类受体的特征基序包括四个保守的胱氨酸和一个色氨酸残基的氨基末端，和间位芳族残基的羧基末端(膜近端的)。二类受体的基序特征是一个在氨基末端这一半中的保守的色氨酸和第二半胱氨酸对，在羧基末端这一半中的WS×WS盒类似物，和第二个保守的半胱氨酸对。
二类中的其它受体是α-干扰素(IFN-α)受体、γ-干扰素(IFN-γ)、组织因子受体，以及一种第二溶解的病毒IFN受体同源物的受体。这里所描述的IL-10受体成份特别与γ-干扰素受体密切相关。这些结构域结构的相似性提示IL-10作用其受体上的机理可能与IFN-γ和其受体的相互作用相似，尽管它是否确切不是本发明的内容。参见例如Levy，et al.，New Biologist 2923(1990);Sen et al.，J.Biol.Chem.2675017(1992);和Uze，et.，al.，Proc.Nat′l Acad.Sci，USA 894774(1992)。
例如，IL-10对由IFN-γ引起的巨噬细胞激活的拮抗作用可直接介入IFN应答的信号联级。这可通过IFN信号途径中的一种成分与IL-10途径中的一种成分相互作用来实现。在两种途径中共有一些成分实际上是可能的，包括活性受体复合物中一种或几种成分的直接结构重叠，例如共有的类β亚单位。
另外，IFN和IL-10受体成分的结构相似性将预示在一种途径中很关键和在另一种途径中保守的受体结构区将具有相同的重要性。这种可预示性延伸至配体分子表面形状和可能与下游信号途径成分相互作用的分子内特性。由此提出调控IL-10生物作用的方法，包括干扰干扰素受体(包括例如IFN的兴奋剂或拮抗体，或与IFN受体突变体同源的IL-10受体变异体的信号转导的步骤。因此期望保守区的中和抗体对该家族中的其它受体具有相似效果。
本发明涉及分离的核酸，例如DNA或编码IL-10受体亚单位的片段的应用。并且，本发明涉及分离的或重组体DNA，或其片段的应用，它们编码的蛋白质同源于每一相关种的变异体或受体，或用编码IL-10受体的cDNA作探针所分离的。被分离的DNA具有5′和3′侧面的相应调控序列，例如启动子，增强子，多聚腺苷酸增加信号，和其它本领域公知序列。这样的核酸一般用作例如编码IL-10受体或其片段的mRNA基因的探针。
本文所定义的一种“分离”的核酸是一种例如RNA、DNA，或混合的聚合物的核酸，它实质上与其它成分分离，所述其它成分是本来伴有的天然序列，例如核糖体、聚合酶和起源种中的侧翼基因组序列。该术语包括已经从其天然存在环境中分离出的核酸序列，和包括重组的或克隆的DNA分离物以及化学合成的类似物或用异源体系合成的生物类似物。一种基本上纯化的分子包括该分子的被分离的形式。
一种被分离的核酸通常是一均匀的分子的组合物，但在一些实例中含有少量不均匀性。这种不均匀性典型地在见于聚合物的两端或对所需生物功能或活性不重要的部分。
“重组的”核酸或者用其制备方法或者根据其结构来定义。参照其制备方法，例如用一种方法制备一种产品，该方法是重组核酸技术的应用，例如包括在核苷酸序列中人为地插入。或者它是一种通过产生一种包括两个片段融合的序列制备的核酸，这两个片段不是天然就相互接邻的，但意指不考虑天然存在的产物，例如天然存在的突变体。
因此，例如本发明包括通过用任何非天然存在的载体转化的细胞制备的产物，也包括用任何合成的寡核苷酸方法得到的序列的核酸。通常用编码相同或保守的氨基酸的丰富的密码子取代一个密码子来达到这一目的，同时典型地引入或移去一个序列识别位点。或者通过连接所需功能的核酸片段得到单个遗传实体来实现，该遗传实体包括所需功能的联合，但这些功能在一般可得的天然形式中未被发现。
本文所定义的核酸“片段”是至少大约17个核苷酸的接邻片段，一般至少21个核苷酸，更一般至少25个核苷酸，普通地至少30个核苷酸，更普通地至少35个核苷酸，经常至少42个核苷酸，更经常至少49个核苷酸，典型地至少58个核苷酸，更典型地至少75个核苷酸，通常至少100个核苷酸，更通常至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选的是至少500个核苷酸，在特别优选的实例中将至少800或更多核苷酸。
编码IL-10受体亚单位或其片段的DNA能用于鉴定编码相关或同源受体的基因、mRNA和cDNA种类，以及编码这些受体成分种的变异体的核酸。如此应用的优选探针编码于不同种变异体之间保守的受体的区。用序列比较可以鉴定保守区。
本发明还涉及具有相同于或高度同源于本文所提及的被分离DNA的DNA序列的重组DNA分子和片段。特别是，该序列经常与控制转录、翻译和DNA复制的DNA片段操作连接。也可以得到含有内含子的基因组序列，以及分离它们的方法。
当进行比较时，同源核酸序列显示明显的相似性。核酸同源性标准是或者用通常用于本领域的序列比较来测定同源性，或者是以杂交条件为基础。在下文中更详细地描述了杂交条件，杂交条件被与其它已知细胞因子受体的同源性进一步地限定，该受体例如上文描述的受体成分。除任何所述参数外，同源性程度将被限制到超过与这些受体的任何此类相似性，这些受体例如GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5受体成分。
基本的核酸序列同源性是指当用适当核苷酸插入或缺失进行适当排列时其片段或其互补链，至少大约50%核苷酸是相同的，一般至少是56%，更一般至少59%，普通地至少62%，更普通地是65%，经常至少68%，更经常至少71%，典型地至少74%，更典型地至少77%，通常至少80%，更通常至少大约85%，最好至少大约90%，更好地至少大约95至98%，在特别实例中高至大约99%或更多的核苷酸。
当在选择的(严格地)杂交条件下使所述片段与一股链或其补体(典型地使用本文定义的序列)杂交时也存在基本的同源性。
所述同源性对比的长度可以覆盖较长范围，且在某些方案中将覆盖至少大约17个核苷酸的范围，通常至少大约20个核苷酸，更通常至少大约24个核苷酸，典型地至少大约28个核苷酸，更典型地至少大约40个核苷酸，最好至少大约50个核苷酸，更好至少大约75至100或更多个核苷酸。
在指杂交作用中的同源性时，严格的条件是指典型控制在杂交反应中的盐、温度、有机溶剂和其它参数的严格结合条件。严格的温度条件通常包括超过大约30℃，更通常超过大约37℃，典型地超过大约45℃，更典型地超过大约55℃，最好超过大约65℃，更好超过大约70℃的温度。严格的盐条件普遍地少于大约1000mM，经常少于大约700mM，通常少于大约500mM，更通常至少少于大约400mM，典型地少于大约300mM，最好少于大约200mM，更好少于大约150mM。然而参数的结合作用比任何单个参数的检测重要的多[Wetmur et al.，J.Mol.Biol.31349(1968)]。
本文所描述的被分离和被鉴定的核酸能用来制备变异体和突变体。它们也能用来制备有用的载体构建体，例如用于制备转基因细胞，包括同源重组作用，例如基因“破坏”(“Knock-out”)动物，以及用于基因治疗。参见Goodnow，“Transgenic Animals”in Roitt(ed.)，Encyclopedia of Immunology，1992，Academic Press，San Diego，pp.1502-1504;Travis，Science 2561392(1992);Kuhn，et al.，Science 254707(1991);Capecchi，Science2441288(1989);Robertson，(ed.)，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells∶A Practical Approach，1987，IRL Press，Oxford;Rosenberg，J.Clinical Oncology 10∶180(1992)。
用核苷酸取代、缺失、插入和颠换能容易地修饰分离的受体DNA。最好在表达产物中保持IL-10结合能力。这样得到的突变体受体能容易地进行如本文所描述的与IL-10的特异性结合试验。用已知方法象位点-特异性突变能制备这些被修饰的序列。例如用修饰的引物、本文所描述的序列和聚合酶链反应(PCR)也能制备修饰的序列。
本发明还提供了重组蛋白质，例如用受体亚单位片段构成的异源融合蛋白质。异源融合蛋白是通常在同样方式存在下不是自然融合的蛋白质或片段的融合物。因此具有受体多肽的免疫球蛋白的融合产物是具有以典型多肽链融合的序列的连续的蛋白质分子，例如典型地制成单个翻译产物并展现由每一肽源带来的性质。相似概念适用于异源核酸序列。
另外，结合其它蛋白质的相似功能区能制备新的构成体。例如，在不同的新的融合多肽或片段之间可以“交换”配体结合或其它片段。参见例如Canningham et al.，Science 243∶1330(1989);和O′Dowd，et al.，J.Biol.Chem.263∶15985(1988)。因此由配体结合特性和细胞内区的功能化结合导致呈现新的特性结合的新的嵌合多肽。例如，对于这些受体的其它结合区来说，其它相关受体的配体结合区可以被加入或被取代。所得蛋白质将总具有杂合功能和性质。
通过Beaucage et al.，Tetra.Letts.221859(1981)所描述的磷酰胺(phosphoramidite)方法能制备适当的合成DNA片段。或者合成其互补链并在适宜条件下一并将所合成链退火，或者利用有适当引物序列的DNA聚合酶加入其互补链，经常通过这两种方法得到双链片段。
本发明提供了制备融合蛋白质的方法。尽管具有显著的结构相似性，但各种受体变异体具有稍微不同的功能或生物活性。用现代分子生物学标准技术分析影响受体不同生理功能或生物活性的结构元件是可能的，特别是在细胞因子受体的相关家族范围中比较变异体。参见描述在Cunningham et al.，(同上) 中的同源扫描诱变技术，以及用在O′Dowd et al.(同上)和Lechleiter et al.，EMBO J.94381(1990)中的方法。
配体结合碎片段能在受体间被取代以测定哪种结构性质对于配体结合亲和力和特异性两者来说是重要的。易受细胞外配体影响的受体片段是这种分析的基本靶物。大量不同受体变异体例如等位变异体将被用来筛选显示有与它们相互作用的结合性质的配体。细胞内功能可能包括通常易受胞液影响的受体片段。然而在某些环境中可以发生受体内在化，也可以发生细胞内成分和称为“细胞外”片段两者间的相互作用。这些细胞内功能通常包括来自结合配体的信号转导。通过诱变或直接的生化方法，例如交联或亲和力方法可以鉴定受体与其它蛋白质相互作用的特异性片段。也可以应用结晶的或其它物理方法进行结构分析。鉴定具有不同功能的受体变异体间的相似性和不同点将产生新的诊断和治疗试剂和处理方法。
能在pMR29和pSW8.1克隆中得到编码IL-10受体亚单位或其片段的核酸，或者能通过化学合成或筛选cDNA或基因组库的方法获得，所述基因组库由细胞系或组织样品制备。
这样的核酸能在许多宿主细胞中表达出完全长度的受体亚单位或受体的片段的合成，然后，例如被用于产生多克隆或单克隆抗体;用来进行结合研究;来进行被修饰受体分子的构成和表达;并用来研究结构/功能。每个受体或其片段能在宿主细胞中被表达，所述宿主细胞是用适当表达载体转化或转染过的。这些分子实际上是不含蛋白质或细胞污染物，而不是从重组宿主产生的，因此特别用于当与药学上可接受载体和/或稀释剂结合时的药物组合物。该受体或其一部分可以作为与其它蛋白质的融合物被表达。
表达载体是典型地自我复制DNA或RNA构建体，该构建体含有例如所需受体基因或其片段，通常与在适当宿主细胞里被识别的适当遗传控制元件操作连接。这些控制元件能影响在适当宿主中的表达。促进表达需要的控制元件的特殊类型取决于实际应用的宿主细胞。一般遗传控制元件包括原核生物的启动子系统或真核生物的启动子表达控制系统，且典型地包括一个转录启动子，可任意选择的操纵基因以控制转录的起始、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码适当核糖体结合位点的序列，以及终止转录和翻译的序列。表达载体通常也包括使得该载体在宿主细胞独立复制的复制起点。
本发明载体含有编码类IL-10肽受体，或其编码一生物活性受体多肽的片段的DNA。该DNA能在病毒启动子的控制下，并能编码选择标志。本发明进一步涉及应用这种能在原核或真核宿主内表达编码受体的真核生物的cDNA的表达载体，其中所述载体与宿主相容，且编码该受体的真核cDNA被插入到载体中使得含有这种载体的宿主的生长表达被讨论的cDNA。通常，表达载体被设计为在其宿主细胞中稳定的复制或为大大增加每个细胞中所需基因拷贝总数目的扩增。并非总需要在宿主细胞复制表达载体，例如有可能影响用载体在各种宿主中能产生IL-10受体或其片段的瞬时表达，所述载体不含有被该宿主细胞识别的复制起源。通过重组作用也可能应用引起IL-10受体或其片段进入宿主DNA的整合作用。
本文所使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、可整合DNA片段和其它能进行使DNA片段进入宿主基因组的整合作用的载体。表达载体是含有影响实现操作连接基因表达的遗传控制元件的特定载体。质粒是最常用的载体形式，但其它具有相当功能和是或变为本领域公知的载体形式也适用于本发明。参见例如Pouwels et al.，Cloning VectorsA Laboratory Manual，1985，和Supplements，Elsevier，N.Y.;和Rodriquez et al.，(eds)，VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston.
转化细胞最好是用由重组体DNA技术构建的受体载体转化过或转染过的哺乳动物细胞。转化的宿主细胞通常表达受体或其片段，但是为克隆、扩增和操纵其DNA的目的，则不需要表达受体。本发明进一步涉及在培养基中培养转化细胞，因此使得受体或片段例如可溶性蛋白质在培养物中积累。受体蛋白质能从细胞或从培养基中被回收。
为了本发明的目的，当其功能彼此相关时，操作连接DNA序列。例如如果被表达为前蛋白质或其参与引导多肽到细胞膜或参与多肽分泌，前序列或分泌引导序列被操作连接于多肽上。如果其控制多肽的转录，则启动子与编码序列操作连接;如果其定位进行翻译，则核糖体结合位点与编码序列操作结合。通常，操作连接是指接邻的和在码内，然而一些遗传元件象阻遏子基因不是接邻键合的，而是与操纵基因序列结合，然后控制表达。
适当的宿主细胞包括原核细胞、低级真核细胞和高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物，例如大肠杆菌和枯草芽胞杆菌。低级真核生物包括酵母，例如啤酒酵母和毕赤氏酵母，以及网柄粘菌属中的种。高级真核生物包括由动物细胞获得的组织培养细胞系，包括非哺乳动物源，例如昆虫细胞和鸟类，以及哺乳动物源，例如人、灵长目动物和啮齿动物。
原核生物宿主-载体体系包括适合许多不同种的宽范围载体。如本文所应用的，大肠杆菌和其载体一般被用于包括其它原核生物应用的相当的载体。扩增DNA的代表性载体是pBR322或很多其衍生物。能用来表达受体或其片段的载体包括但不限制于这样的载体，即那些含有lac启动子(pUC-系列);trp启动子(pBR322-trp);Ipp启动子(pIN-系列);λ-pP或pR启动子(pOTS);或者杂交启动子象ptac(pDR540)。参见Brosius等.，“Expression Vectors Employing Lambda-，trp-，lac-，and Ipp-derived Promoters”，in VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，(eds.Rodriguez and Denhardt)，1988，Buttersworth，Boston，Chapter 10，pp.205～236。
可以用含有载体的IL-10受体序列转化低级真核生物，例如酵母和网柄粘菌属。为了本发明的目的，最普通的低级真核生物宿主是面包酵母，啤酒酵母。尽管也能应用许多其它的株和种，但上述酵母通常用来代表低级真核生物。酵母载体典型地包括复制起源(整合型除外)、选择基因、启动子、编码受体或其片段的DNA、翻译终止及多聚腺苷酸化作用和转录终止序列。适当的酵母表达载体包括象构成启动子如3-磷酸甘油酯激酶和各种其它糖酵解酶基因启动子或可诱导(inducible)启动子象乙醇脱氢酶2启动子或金属硫堇启动子。适当的载体包括下面类型的衍生物自我复制的低拷贝数(象YRp-系列)，自复制高复本数(象YEp-系列);整合类型(象YIp-系列)，或者小染色体(象YCp系列)。
生长在组织培养物中的高级真核细胞通常是用于表达功能活性IL-10受体蛋白质的优选宿主细胞。原则上，任何高级真核组织培养细胞系都是可用的，例如昆虫杆状病毒表达系统，无论源于无脊椎动物或者源于脊椎动物。然而，通常优选哺乳动物细胞。细胞的转化或转染以及繁殖已成为常用的方法。有用的细胞系的例子包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、幼鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟类细胞系以及猴(COS)细胞系。
这样的细胞系表达载体包括复制起源、启动子、翻译起始位点、RNA拼接位点(如果使用基因组DNA)、多聚腺苷酸化(polyadenylation)位点以及转录终止位点。这些载体通常也含有选择基因或扩增基因。适合的表达载体可以是质粒、病毒、或者载有例如由象腺病毒、SV40、牛痘病毒或巨细胞病毒这些来源中得到的启动子的逆转录病毒。适当的表达载体的代表性例子包括pCDNA1(Invitrogen，San Diego，CA);pCD[Okayama et al.，Mol.Cell Biol.51136(1985)];pMClneo Poly-A[Thomas et al.，Cell 51503(1978)];以及杆状病毒载体象pAC 373 or pAC 610[O′Reilly et al.，Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual，1992，Freeman & Co.，N.Y.
通常希望在提供特定的或确定的糖基化方式的系统中表达受体多肽。这种情况下，通用方式由表达体系自然提供。然而，通过向被引入异源表达体系的适当的糖基化蛋白质暴露该多肽，例如一种非糖基化形式，将修饰这种方式。例如用一种或几种编码哺乳动物或其它糖基化酶的基因可以与该受体基因共同转化。用这种方法，在原核生物或其它细胞中能实现某些哺乳动物糖基化作用方式。
本发明的核酸将提供具有高受体蛋白质含量的有用材料来源。表达这些蛋白质的细胞是纯化蛋白质的天然受体形式或其变异体的来源。另外，纯化片段能与受体的适当部分融合以帮助分离和制备。例如FLAG序列，或功能等同物，能通过一种可除去蛋白酶序列与蛋白质融合，使得FLAG序列被一种亲和试剂识别，且纯化的蛋白质易受蛋白酶消化而移去延伸部分。
存在许多其它等价片段，例如对重金属柱试剂具有亲和特性的多聚组氨酸片段。参见例如Hochuli，Chemische Industrie 12∶69(1989);Hochuli，“Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Adsorbent”in Setlow(ed)，Genetic Engineering，Principle and Methods 12∶87，1990，Plenum Press，N.Y.;和Crowe et al.，QIAexpress∶The High Level Expression & Protein Purification System，1992，QUIAGEN，Inc.Chatsworth，CA.
而且，适当的宿主细胞可以被用于高水平地并在允许进行所需翻译后加工的条件下表达受体蛋白质，例如糖基化作用变异体。
制备出高水平表达物后，应用标准的蛋白质纯化技术将IL-10受体成分纯化至接近均一。这些方法包括硫酸铵沉淀法、柱色谱、电泳、离心、结晶和其它。参见例如Ausubel et al.，1987和定期增刊，Current Protocols in Molecular Biology;Deutscher，“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology Vol 182，1990，以及此系列中的其它内容;以及蛋白质纯化产物的应用方面的合成文献，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，CA。
本发明还提供了IL-10受体亚单位盐和被标记的衍生物。这样的衍生物可以包括与化学基团的共价或集聚化合。这些衍生物通常分为三类(1)盐，(2)侧链和末端残基共价修饰，和(3)吸附复合物，例如与细胞膜吸附。这样的共价或聚集衍生物用作免疫原、免疫分析中的试剂，或被用于纯化方法中，象IL-10或其它结合配体的亲和纯化中。
例如用本领域公知的方法通过共价键使IL-10受体或其可溶解形式固定在固相载体上例如溴化氰活化的琼脂糖上，或吸附到聚烯表面，有或没有戊二醛交联，用于抗IL-10受体抗体或IL-10的分析或纯化。也能用可检测基因标记IL-10受体，例如用氯胺T放射性碘标记的方法，与稀土螯合物的共价键合，或与另外一个用于诊断分析中的荧光基团共轭。
本发明的可溶性IL-10受体能被用作制备特异于该受体或其片段的抗血清或抗体的免疫原。被纯化的受体能被用来筛选单克隆抗体或由用含有IL-10受体的不纯产物的不同形式进行免疫制备的抗原结合片段。
术语“抗体”也包括天然抗体的抗原结合片段。该被纯化的受体也能被用作测定应答存在提高水平的IL-10受体或含有IL-10受体细胞片段而生成的抗体的试剂。另外，IL-10受体片段也可以作为免疫原来产生本发明的抗体，如下文就要描述的。例如，本发明涉及具有结合亲和力或抗本文所定义的氨基酸序列或其片段的抗体。
特别是，本发明涉及具有结合亲和力或抗特定片段的抗体，所述片段被预测在脂质双层外侧。这些片段容易地变成人或鼠受体序列外观上的构成。另外，本发明涉及被预示将存在于膜的细胞外侧上的IL-10受体片段。分析蛋白质结构以鉴定膜相关区被描述在例如来自Heijne，J.Mol.Biol.225∶487(1992);和Fasman et al.，Trends in Bioc Hemical Sciences 1589(1990)。
能产生针对受体亚单位或其片段各种变异体的抗体(以其天然存在形式和其重组体形式)。另外能产生对IL-10受体的活性形式或其失活形式的抗体，不同点在于活性受体更易于识别只存在于活性受体中的抗原决定簇。能用标准方法制备抗独特基因型抗体。
通过用所说片段与产生免疫性的蛋白结合物免疫动物能产生抗IL-10受体预先测定片段的抗体，包括结合片段和单链译本。从分泌所需抗体的细胞中制备单克隆抗体。通过结合正常的或缺损的IL-10受体筛选这些抗体，或筛选拮抗或兴奋IL-10受体活性。
正常地，这些单克隆抗体将与至少大约1mM的1Kd结合，更正常地至少300μM，一般至少100μM，更一般至少30μM，平常至少10μM，更平常至少3μM，经常至少1μM，更经常至少300nM，典型地至少100nM，更典型地至少30nM，通常至少10nM，更通常至少3nM，最好至少1nM，更好至少300pM，在特别优选的实施例中至少100至10pM或更少。
本发明的抗体，包括抗原结合片段具有极高的诊断或治疗价值。它们是与IL-10受体结合和抑制配体与受体结合或抑制类IL-10肽引起生物应答的能力的有效拮抗剂。也能将它们用作非中和抗体并能与毒素或放射性核素偶联，使得当抗体与受体结合时，细胞自身被杀死。并且这些抗体能与药剂或其它治疗试剂结合(直接或间接地通过键合)。
本发明抗体也能用于诊断应用中。作为捕获或非中和抗体，它们能与IL-10受体结合而不抑制配体结合。作为中和抗体，它们能用于竞争结合分析中。它们也用于测定或定量IL-10或IL-10受体。
受体片段可以与其它材料连接，特别是多肽，如被用作免疫原的融合的或共价连接的多肽。IL-10受体和其片段可以与许多免疫原融合或共价联接，象锁眼
血蓝蛋白、牛血清白蛋白、破伤风类毒素等等。参见制备多克隆抗血清方法的文献Microbiology，Hoeber Medical Division，Harper and Row，1969;Landsteiner，Specificity of Serological Reactions，1962，Dover Publications，New York;and Williams et al.，Methods in Immunology and Immunochemistry，Vol.1，1967，Academic Press，New York.
在一些情况下，希望从不同哺乳动物宿主制备单克隆抗体，象小鼠、啮齿动物、牛、羊、驴、灵长目类动物、人等。在下面文献中可以发现用于制备这样单克隆抗体的技术的描述，例如Stites et al.(eds)，Basic and Clinical Immunology，4th ed.，Lange Medical Publications，Los Altos，CA;Harlow and Lane，Antibodies∶ALaboratory Manual，1988，CSH Press;Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(2d ed)，1986，Academic Press，New York;以及特别是在Kohler和Milstein，Nature 256495(1975).
简言之，本方法包括给动物注入免疫原。然后处死该动物，从其脾中取出细胞，然后与骨髓瘤细胞融合。其结果是得到能在体外再繁殖的杂交细胞或“杂交瘤”。然后筛选杂交瘤群来分离各个克隆，每个克隆分泌针对免疫原的单个抗体种类。在这种方法中，所得到的各处抗体种类是永久性的和是来自免疫动物的克隆单个B细胞在应答被识别的致免疫物质上的特异性位点所产生的产物。
其它适合的技术包括在体外使抗原多肽接触淋巴细胞或涉及筛选噬菌体或类似载体中的抗体库。参见Huse et al.，“Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda，”Science 246∶1275(1989);以及Ward et al.，Nature 341∶544(1989).
本发明的多肽和抗体可以在有或没有改变的情况下都可以被使用，包括嵌合的或人化的抗体。常常通过与一提供可测信号物质相连(共价或非共价)来标记多肽和抗体。许多标记和结合的技术是公知的，在科技和专利文献中都有大量报导。适当的标记包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制物、荧光基团、化学发光基团、磁粉等等。公开这样标记的使用的文献包括美国专利3817837;3850752;3939350;3996345;4277437;4275149;及4366241。也可以制备重组免疫球蛋白，参见Cabilly，美国专利4816567;和Moore等人，美国专利4642334。
本发明的抗体能被用于分离该受体的亲和色谱法。制备色谱柱，其中抗体与固相载体连接，例如颗粒，象琼脂糖、交联葡聚糖等等，将细胞溶解物通过柱子，洗柱，然后增加温和变性剂浓度，最后释出被纯化的受体蛋白质。
该抗体也可以被用来筛选特别表达产物的表达库。通常用一基团标记用在这种方法中的抗体，使得容易通过抗体结合测定抗原的存在。这种抗独特基因型抗体被用作检测或诊断各种与各个受体表达相关的免疫状态。
可溶性受体片段也能被用作IL-10的载体，例如，保护细胞因子不受各种降解的或其它的活性的影响。在某些条件下，复合物被用作缓释组合物，使细胞因子或拮抗剂缓慢地功能释放。而且，作用IL-10的一种拮抗剂，可溶形式的受体，例如含有没有膜相关片段的细胞因子结合部分的片段，将是有用的诊断或治疗的组合物。作为一诊断试剂，这种片段能被用作抗IL-10抗体的替代物，但可能相当于一中和抗体。
另外，本文所描述的被分离的成分可能是其它细胞因子受体α亚单位的类似物。这意谓着可以存在IL-10受体的独特的β成分，并且与这些成份缔合，由IL-10结合调制活性。这将提供方便的分离这种被称这β亚单位的方法。参见例如，Hayashida et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 87∶9655(1990)。或者，种或组织特异性附属分子，例如蛋白质，可以提供改变受体蛋白质性质或活性的源由。
本发明的天然存在和重组体形式的IL-10受体亚单位应用于能筛选与受体有结合活性的化合物的药盒和分析方法中。近几年已开发了几种自动分析方法，能每年筛选成千上万种化合物。参见例如，Fodor et al.，Science 251∶767(1991)，其中描述了用许多在固相底物上合成的确定的多聚物试验结合亲和力的方法。各种任意的多肽序列的噬菌体或其它文库也是有用的。能得到大量的象本发明所提供的被纯化的可溶性受体，能大大促进适当的分析方法的发展。
例如，一旦受体被定性，一般就能发现其拮抗剂。随着应用纯化的受体的高度自动化分析方法的发展，现在能试验可能的受体拮抗剂。特别是，用本文所提供试剂实现的筛选技术将发现新的兴奋剂或拮抗剂。
本发明特别用于通过使用重组体受体(在任何范围药剂筛选技术中)筛选化合物。用重组体受体筛选受体反应药物的优点包括(a)改善的由特定来源得到的受体的可恢复的源;
(b)每个细胞中潜在的在分析中产生更好的信噪比较大数目的受体;以及(c)种的变异体的特异性(理论上产生较大的生物和疾病特异性)。
一种药物筛选的方法是使用用表达该受体的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。从任何其它细胞中能分离在分离作用中表达受体的细胞。这种能存活的或固定形式的细胞能被用于标准的受体/配体结合分析。参见Parce et al.，Science 246∶243(1989);和Owicki et al.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 874007(1990)。
竞争性测定是特别有用的，其中用已知对该受体有结合亲和力的标记配体(象125I-IL-10)和试验化合物及细胞(IL-10受体的来源)一起接触和保温，该试验化合物对IL-10受体的结合亲和力是已被测定的。然后分离结合的配体和游离的配体以确定配体结合的程度。试验化合物被结合的数量与被测定的标记配体被结合的数量成反比。可使用任何技术从游离的配体中分离结合的配体从而确定配体结合的程度。这种分离步骤典型地包括例如与滤器粘附然后洗脱、与塑料粘附然后洗脱或细胞膜的离心。
能存活的细胞也能被用来筛选对以IL-10受体介导的功能有效的药物，例如第二信使含量，即Ca++;细胞增殖;磷酸肌醇池变化;磷酸化作用水平;一氧化二氮的含量和其它。一些测定方法省去了一个分离步骤，例如近似灵敏测定系统。钙灵敏染色将用于测定Ca++含量，用氟量计或一种荧光细胞分类仪。参见Lowenstein et al.，Cell 70705(1992)。
另一种方法是用来自被转化的真核或原核宿主细胞的膜作为IL-10受体的来源。这些细胞被指导IL-10受体表达的DNA载体稳定地转化。基本上这些膜能由细胞制备并被用于适当的受体/配体结合分析，例如上文所提到的竞争性分析。
还存在另外一个方法是使用由被转化的真核或原核宿主细胞得到的可溶性未纯化或可溶性被纯化的受体。这用来做“分子”结合分析，其优点是增加了特异性、自动化能力和高的药物试验生产量。
另外一种药物筛选技术包括一种方法，它提供了筛选具有适当的IL-10受体结合能力的化合物的高生产量，并详细描述在Geysen，欧洲专利申请84/03564中。首先在固相载体底物例如塑料栓或某些其它适宜表面上合成大量不同的短肽试验化合物。然后所有的栓与可溶的未被纯化的或可溶的被纯化的IL-10受体反应，并洗涤，下一步包括测定结合的IL-10受体。
常规的药物设计也取决于对受体和其它效应物或配体的分子形状的结构研究。效应物可以是在应答配体结合中介导其它功能的其它蛋白质，或通常与受体相互作用的其它蛋白质。测定与特定的其它蛋白质相互作用位点的一种途径是物理结构测定，例如，X-射线结晶法或NMR技术(二维或三维)。这些将提供氨基酸残基形成分子接触区的目标。
被纯化的受体可直接包括在平盘上用于上文所提到的药物筛选技术。然而，这些受体的非中和抗体能被用作捕获抗体将各个受体固定在固相上。
恰当地通过竞争抑制作用，由配体与受体结合的抑制作用可以阻碍对类IL-10多肽的生理反应，因此，本发明的体外分析经常使用由表达重组受体的细胞分离的膜、含有这些受体的配体结合片段的可溶性片段或者是附着于固相底上的片段。这些分析也用来进行结合片段突变和改变或配体突变和改变(例如配体类似物)的效果的诊断上的测定。
本发明也涉及竞争性药物筛选分析法的应用，例如其中受体或受体片段的中和抗体与和受体结合的试验化合物竞争。在这种方法中，抗体能被用于测定占据受体一个或多个结合位点的任何多肽的存在，且也可被用于占据可能被IL-10占据的受体上的结合位点。
另外，抗受体和含有配体结合位点的受体的可溶性片段的中和抗体能被用来抑制例如噬菌体、B细胞、T细胞或相关细胞类型中的IL-10受体功能。
本发明还涉及许多诊断药盒中的IL-10受体、其片段、多肽和其融合产物的应用以及测定IL-10受体存在的方法。典型情况下，该药盒含有或者被确定的受体肽或者基因片段，或者识别一者或另外一者的试剂。
测定试验化合物与IL-10受体结合亲和力的药盒典型地包括试验化合物;标记化合物，例如具有已知与IL-10受体结合亲和力的配体或抗体;IL-10受体的来源(天然存在的或重组体)，从游离的标记化合物中分离结合化合物的手段，例如固定IL-10受体的固相。一旦筛选了化合物，这些与IL-10受体具有适当的结合亲和力的化合物能用于本领域公知的适当生物分析法中来测定它们是否是兴奋剂或拮抗剂。这些重组体受体多肽的获得也很好地确定了校准此种分析法的标准。
测定例如样品中IL-10受体浓度的优选的药盒典型地包括具有已知与该受体结合亲和力的配体或抗体，IL-10受体的来源(天然存在的或重组体)以及从游离的标记化合物中分离结合的标记化合物的手段，例如一个固定IL-10受体的固相。正常地将提供含有试剂的小室和说明书。
特异于受体或受体片段的抗体，包括抗原结合片段能用于测定存在升高含量的受体和/或其片段的诊断应用中。这种诊断分析能应用溶胞产物、活细胞、固定细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液，并能进一步包括与血清中IL-10受体相关的抗原的测定等等。诊断分析可以是均相的(没有游离试剂与受体-配体复合物之间的分离步骤)或非均相的(有一分离步骤)。存在各种各样的化学分析方法，象放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、酶免疫分析(EIA)、复酶免疫分析技术(EMIT)、底物标记的荧光免疫分析(SLFIA)等等。例如，通过使用一个被标记的且识别IL-10受体或其特异片段抗体的第二抗体能应用未被标记的抗体。这些分析法在文献中有大量的讨论，参见例如Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，1988，CSH。
抗独特基因型抗体具有诊断抗受体抗体存在的相似用途。例如可以是各种异常状态的诊断。例如IL-10受体的过量或不适合产物可以导致各种免疫反应，这些免疫反应可以诊断异常受体表达，特别是在增生细胞情况下例如癌。
通常，诊断分析试剂被装入药盒以优化分析的灵敏性。对于本发明，依据分析方法的性质、草案和标记物的不同，提供或者被标记的或者未被标记的抗体，或者被标记的受体。通常与其它附加成分相结合，象缓冲液、稳定剂、信号产生所必须的原料(象酶的底物)，等等。最好，该药盒也含有适当使用的说明书以及使用后的处理。典型地，该药盒具有每个有用试剂的各室。希望该试剂能以干燥的冻干粉提供，该试剂能在水介质中重建，具有适当浓度来进行分析。
任何药物成分的筛选和诊断分析可以在没有改变的情况下或也可以在通过各种途径修饰后进行。例如可按上文的描述进行标记。
也有很多方法从游离配体中分离出结合配体或者从游离试验化合物分离结合化合物。这些受体能被固定在不同固体上然后洗脱。适当的固体包括塑料象ELISA平板、滤膜和珠子。将受体固定到基质上的方法包括，不限制于，直接附着于塑料上、应用捕获抗体化学偶联和生物素-抗生物素蛋白。这种技术的最后一步包括用几种方法中的任何一种沉淀受体/配体复合物，包括使用例如一种有机溶剂象聚乙二醇或一种盐象硫酸铵。其它适当的分离技术包括而不限制于荧光素抗体磁粒方法，该方法描述在Rattle et al.[Clin.Chem.301457(1984)]，和描述在U.S.Patent No.4659678中的双抗体磁粒分离方法中。
本发明的另一诊断方面包括由IL-10受体序列得到的寡核苷酸或多核苷酸序列的应用。这些序列能被用作测定病人的限定细胞中受体异常水平的探针，这些病人疑为具有例如自身免疫疾病，不能正常应答炎症的感染，或增殖细胞疾病象癌。文献中充分描述和讨论了RNA和DNA两种核苷酸序列的制备、序列的标记和序列优选的大小。
正常情况下寡核苷酸探针应具有至少大约14个核苷酸，通常至少大约18个核苷酸，多聚核苷酸探针可以有多至几千碱基对，可以使用多种标记，最常用的是放射核素，特别是32P。然而也可以使用其它技术，象引入多核苷酸的光或生物素修饰的核苷酸。然后生物素作为结合抗生物素或抗体的位点，这个位点可用很多标记物标引，象用放射性核素、荧光、酶等等。
或者，可以应用识别特异性双螺旋的抗体，包括DNA双螺旋，RNA双螺旋、DNA-RNA杂交双螺旋，或DNA-蛋白质复合物。然后，抗体可以被标记，并进行分析，其中双螺旋与一个表面结合，因此由双螺旋在表面上的形成可测定与双螺旋结合的抗体的存在。用经典技术可实施新的反义RNA探针的应用，象核酸杂交，加减筛选、重组探针，杂交释放翻译(HRT)，以及杂交阻止翻译hybrid arrested translation(HART)。也包括扩增技术象聚合酶链反应(PCR)。
本发明还涉及定性或定时地测定其它标志存在的诊断药盒。诊断或预后决定于用作标记物的多种指示物。因此，药盒可以验定标志物的结合。参见例如Viallet et al.，Progress in Growth Facter Res.189(1989)。
本发明提供了具有显著治疗价值的试剂。IL-10受体(天然存在的或重组体)，其片段与抗体，以及被鉴定为对IL-10受体具有结合亲和力的化合物，在治疗多种疾病中是有用的，例如自身免疫疾病，脓毒性和毒性休克和传染病。参见例如Hsu et al.，Int′l Immunol.4563(1992);de Waal Malefyt et al.，J.Expt′l Med.1741209(1991);Fiorentino et al.，J.Immunol.1473815(1991);和Ishida et al.，J.Expt′l Med.1751213(1992)。另外，本发明对与IL-10受体的异常表达或异常触发相关的任何疾病和失调具有治疗意义。例如，确信IL-10受体在免疫作用的许多基本调控过程中起着作用。应用本发明将发展细胞因子的兴奋剂和拮抗剂。也参见例如Harada et al.，J.Biol.Chem.26722752(1992)，该文中鉴定了在拮抗受体功能中有用的受体片段。
重组IL-10受体，包括其可溶性片段，或IL-10受体的抗体能被纯化，然后施予患者。为了治疗应用，这些试剂能与附加的活性成分混合，例如，经典的药学上可接受的载体或稀释剂，以及生理上无害的稳定剂和赋形剂。这些混合物经无菌过滤并制成剂形如通过真空冷冻干燥法放入剂量瓶中或稳定的水合制剂中。本发明也涉及抗体或其结合片段的应用，例如，所说抗体或其结合片段是可溶的，不是互补结合的。
用IL-10受体或其片段能实现药物筛选，以鉴定与IL-10受体具有结合亲和力的化合物。然后应用下一步的生物分析来测定化合物是否具有固有的促进活性且因此是其阻滞IL-10活性的阻滞剂或拮抗剂。同样地，具有内在促进活性的化合物能活化受体，因此是在促进IL-10活性中的兴奋剂。本发明还涉及IL-10受体的抗体作为拮抗剂的医疗应用。
进行有效治疗需要的试剂的量决定于许多不同的因素，包括施用方式、靶位点、患者生理状态，以及其它施用药物。因此应该滴定治疗剂量以达到理想的安全性和效力。典型地，体外使用的剂量能对用于这些试剂原位施用的量提供指南。处理特定疾病的有效剂量的动物试验将进一步提供人剂量的预定的指征。已公开了多种情报，例如in Gilman et al.(eds)，Goodman and Gilman′s∶The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th Ed.，1990，Pergamon Press，和Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，1990，Mack Publishing Co.，Easton，Penn。
本申请讨论了施用方法，例如口服、静脉内、腹膜内，或肌内施用，透皮扩散以及其它。药学上可接受的载体包括水、盐水、缓冲液和其它化合物，描述在例如Merck Index，Merck and Co.，Rahnay，New Jersey.由于IL-10和其受体间的高亲和力结合，这些试剂的低剂量最初是被希望是有效的。因此，剂量范围通常希望是低于1mM浓度的量，典型地少于大约10μM浓度，通常少于大约100nM，最好少于大约10pM(微微摩尔)，最好少于大约100fM(毫微微摩尔)，以及适当载体。缓释剂或缓释装置经常被用于连续施用。在下面详细的描述中将发现受体细胞内片段，包括IL-10受体和相近受体两者的另外用途。
可以直接向被处理宿主施用IL-10受体、其片段、该受体或其片段的抗体、拮抗剂以及兴奋剂，这取决于该化合物的大小，希望在施用前将其与载体蛋白质象卵白蛋白或血清卵白蛋白结合。可以以任何常用的剂量配方施用治疗制剂。尽管可能单独服用活性成分，但最好是以药物组合物施用。
这样的组合物包括至少一种活性成份，如上所定义的，以及一种或几种其可接受的载体。每种载体必须是药学上和生理上两者可接受的，易于与其它成分互容的且对患者无害。制剂包括那些适于口、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内和真皮内的)施用。
制剂常常以单位剂量形式存在，并可用药学领域公知的方法制备。参见例如Avis et al.(eds)，Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications，1993，Dekker，New York，Lieberman et al.(eds)，Pharmaceutical Dosage FormsTablets，1990，Dekker，New York，和Lieberman et al.(eds)，Pharmaceutical Dosage FormdDisperse Systems，1990，Dekker，New York。本发明治疗方法可以与其它化学治疗或化学预防试剂结合或用于与其它化疗或化学预防试剂的缔合作用。
通过标准的基因治疗技术也能传递本发明的物质，所述基因治疗技术包括例如直接将DNA注入组织、重组病毒载体的使用和被转染细胞的移植。参见例如Rosenberg，J.Clin.Oncol.10180-199(1992)。
很可能存在另外的IL-10受体亚单位。在不同生物分析方法中IL-10显示不同特定的活性(每mg蛋白质的单位)。例如在细胞合成抑制因子分析中其中IL-10作用于巨噬菌细胞上IL-10的比活性比在鼠胸腺细胞或鼠肥大细胞增生作用的共同刺激作用中发现的IL-10比活性要高。
尽管还没有证实每个成分自身结合vIL-10的能力，本申请提供的人和鼠IL-10受体结合IL-10。重组受体(100～400pM)的表观Kd比巨噬细胞和单核细胞(5～20pM)上IL-10的EC50高得多。由于与相关的2类细胞因子受体的类似性，例如IFN-α，IFN-β，或IFN-γ，它们的结构特点相似，可能需要一辅助分子进行IL-10结合上的信号转导。
能用多种途径筛选这样的辅助成分。这些途径包括物理亲和方法和活性筛选。这里用于人IL-10的相似亲和方法能用于vIL-10。因为vIL-10是有生物活性的，但没有发现与亚单位的结合，因此可以存在几种该受体的修饰形式。FLAG-vIL-10融合构建物在含有这样一种受体形式的细胞的选择性纯化中应该是有用的。
一种途径是转染由适当细胞，例如能应答vIL-10的细胞得到的文库，来筛选转染的不应答vIL-10的细胞;或者不能与vIL-10(或FLAG-vIL-10融合作用)结合。在浓度太低以致只能有效地与本发明受体亚单位结合的浓度下用FLAG-vIL-10标记筛选这样一个被转化的细胞库。参见例如Kitamura et al.，Cell 661165(1991)。
或者，FLAG-vIL-10融合构建物能被用于描述或FACS分离，例如如下面所描述的。这些技术可以和与已分离的IL-10成分的共转染作用相结合，例如来分离改变了结合性质的辅助成分。特别希望在缔和时增加配体结合亲和性的成分。用这种方法分离的cDNA克隆例如通过测序来描述特征，并与其它在其它受体中鉴定的亚单位或辅助蛋白质进行结构比较。
实施例可通过下面非限制性实施例详细陈述本发明。除非特别指出，下面给出的固体混合物中的固体、液体中的液体和液体中的固体的百分数分别以wt/wt，vol/vol和wt/vol来表示。
下面实施例表明在几种鼠和人细胞系中具有高比活的碘化人IL-10(hIL-10)能以特异的和饱和的方式与IL-10受体结合。MC/9增生作用分析证明该标记蛋白质保留了大于50%的生物活性。被纯化的碘化蛋白质的分子量大小表明蛋白质大多以二聚体形式存在，且在这种形式下能与其受体特异性结合。当在还原条件下用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法[SDS-PAGE;Laemmli，Nature 227680(1970)]实验时，37kDa人IL-10二聚物可以被洗涤剂离解为单个的18kDa IL-10。这些代表存在共价连接的细胞因子二聚物的37kDa物质一致。而且证明活性hIL-10是非共价连接的二聚物。
用几种源于鼠和人的细胞系进行的特异性结合筛选表明，鼠科肥大细胞系MC/9和人B淋巴瘤系JY在每个细胞中具有极高数目能结合的，例如未被占据的受体。相对于MC/9和JY来说，人B细胞系Ramos和BH5以及红血白病细胞系TF-1以降低的水平结合，下面紧跟着是人T细胞和巨噬细胞系。在已报导的观察基础上即肥大细胞，巨噬细胞/单核细胞、B细胞和T细胞应答IL-10来选择这些细胞系。通常由红血白病患者处得到的TF-1细胞系依赖于IL-3、红细胞生成素或GM-CSF作长期生长。在增生分析中这些细胞系也应答IL-4、IL-5和IL-6。尽管TF-1细胞系应答各种细胞因子，但没有测得细胞因子单独或与其它细胞因子结合对TF-1细胞应答hIL-10的增生效果。
由Scatchard分析获得的Kd数值表明hIL-10以相对高的亲和力与其鼠和人细胞上的受体结合，每个细胞中有100至300未被占据的受体。用鼠肥大细胞系MC/9和人细胞系JY上的人和鼠科IL-10的竞争结合分析证明，当鼠配体能与鼠细胞系竞争结合碘化的hIL-10时，它不能与人细胞系相竞争。一种解释是在所用的结合条件下，hIL-10能识别并与鼠和人受体两者结合，而鼠IL-10只能识别鼠受体。支持鼠配体的结合识别位点有种特异性这种观点的是人细胞上不存在鼠科IL-10的任何显著的生物交叉反应活性。
实施例1一般方法细胞系和组织培养MC/9细胞ATCC＃CRL 1649在带有10%胎牛血清的Dulbecco′s改良基本培养基(DMEM)中正常生长，所述10%胎牛血清(FBS)中含有3～5%促细胞分裂剂刺激的脾调理介质，100U/ml mIL-4，10U/ml青霉素/链霉素，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1×MEM必需和非必需氨基酸，1×MEM维生素，50μMβ-巯基乙醇，6mg/升叶酸，116mg/升L-精氨酸，和36mg/升L-天冬酰胺。TF-1细胞[Kitamura et al.，J.Cell.Physiol.140323(1989)]在带有10%FBS和1μg/升鼠GM-CSF的RPMI1640中培养。JY细胞(由J.de Vries，DNAX，Palo Alto，CA获得)在带有10%FBS，6mM谷氨酰胺，和抗生素的DMEM中生长。其它细胞系[Ramos(ATCC＃CRL1596)，WEHI 265.1(TIB 204)，U937(CRL 1593)，HL-60(CCL 240)，JD(CRL 8163)，Jijoye(CCL 87)，THP-1(TIB 202)，B-JAB(由J.Banchereau，Schering-Plough France获得)和BH-5(由W.Tadmori，Schering-Plough Research Institute，SPRI处获得)]在带有10%FBS，6mM谷氨酰胺和抗生素的RPMI中培养。另外，用50μMβ-巯基乙醇补足BH-5和THP-1细胞的培养基。所有组织培养试剂由GIBCO(Gaithersburg，MD)购得。荧光活化的细胞分类(FACS)用标准方法在Becton-Dickinson FACStar PLUS上完成FACS。参见例如Shapiro，Practical Flow Cytometry(2d ed.)，1988，Alan Liss，New York。
细胞因子和抗体由Schering-Plough Research Institute(SPRI)，New Jersey提供重组CHO-衍生的人IL-10和IL-5，以及大肠杆菌衍生的人GM-CSF，IFN-γ和鼠IL-10。通过MC/9增生作用分析(见下文)测得这些产物的比生物活性是2.3×107单位/mg(对于hIL-10来说)，且对mIL-10是1.6×107单位/mg。重组hIL-6由Genzyme(Cambridge，MA)购得。IL-10和IL-5的单克隆抗体由J.Abrams[DNAX，Palo Alto，CA;参见Abrams et al.，Immunol.Rev.1275(1992)]提供，但也可以用标准方法制得。
人IL-10的碘化作用用酶球(Enzymobead)放射性碘化试剂(Bio-Rad，Richmond，CA)标记纯化的hIL-10蛋白质，按照制造商的议定书，这是一种乳过氧化物酶和葡氧酶的被固定的制剂。将纯化蛋白质通过PD-10柱(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJ)以除去游离标记物。用乳过氧化物酶方法(NEN Research Products，Boston，MA)也碘化加入的样品。所得到的比放射活性范围在100～180μCi/μg hIL-10。然后将碘化的原料通过120ml交联葡聚糖凝胶G-75柱(Pharmacia LKB)，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中收集1.1ml馏分。通过在4℃下在10%三氯乙酸中将收集的馏分的等份培养1小时实现TCA沉淀作用。离心后生成小球状沉淀物，然后在Clinigamma计数器上计数(Pharmacia LKB)。MC/9增生作用分析应用比色MTT染色-还原作用分析测定hIL-10的生物活性，参见例如Tada，et al.，J.Immun.Meth.93157(1986);和Mosmann，J.Immun.Meth.6555(1983)。简言之，用不同量的人IL-10处理在96孔微量滴定板中含有100U mIL-4/ml的培养基(100μl)的每井5×103MC/9细胞48小时。应用的hIL-10标准物的最大值是200单位/100μl并连续稀释两倍。加入25微升5mg/ml MTT并温育3至5小时。然后在10%SDS中用10mM HCl去污剂解离细胞，且读取平板在570nm的吸光度。
结合实验和Scatchard分析在200×g离心10分钟，将用于试验的每种细胞系大约5×106个细胞球状沉淀化，在PBS中洗涤，再悬浮于200μl含有100-500pM碘化的hIL-10的结合缓冲液中(PBS，10%胎牛血清，0.1%NaN3)。在4℃下于旋转混合器中温育2小时后，将细胞在200×g离心10分钟，再悬浮于100μl无标记hIL-10的结合缓冲液中，在伸长的微离心试管中覆盖一层200μl 1∶1邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二辛酯油状物的混合物，在4℃下在400×g离心5分钟，在液氮中速冻。然后将细胞小球破碎并在Clinigamma 1272计数器(Pharmacia LKB)上计数。通过在500至1000倍摩尔过量未标记hIL-10的存在下进行结合，未测得特异性的结合。
在饱和结合实验中使用了大约600pM碘化hIL-10溶液的两倍连续稀释物，同时做一平行系列以测定非特异性结合。在用EBDA Program(Elsevier-Biosoft，Cambridge，U.K.)获得的数据点上进行Scatchard分析。在上述结合条件下并加入100倍摩尔过量的每种单克隆抗体进行抗体抑制作用。在相似条件下再加入500倍摩尔过量指定的细胞因子测定细胞因子的特异性。
化学交联在2ml由PBS，0.1%NaN3，10%牛血清白蛋白和有或没有200nM未标记hIL-10的200pM125I-hIL-10构成的结合介质中于4℃下将大约2×108个细胞温育4小时。细胞用PBS洗两次，然后再悬浮于1ml PBS中。向细胞悬浮物中加入10微升15M1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC;Pierce Chemical Co.)贮存液，用恒定摇荡在室温下将细胞温育1小时。
用冷PBS两次洗涤细胞，然后加入150mM甘氨酸(pH7.2)终止反应，用Tris-HCl缓冲。离心收集细胞，通过加入1ml含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，140mM NaCl，2mM EDTA，1mg/ml亮肽素(Sigma)，2mM Prefabloc SC(Boehringer Mannheim)，2mM碘代乙酰胺(Sigma)，2mM邻二氮杂菲(Sigma)和1%三硝基甲苯X-100(Sigma)的裂解缓冲液裂解，裂解物于4℃在10000×g离心20分钟。
收集上清液，与用标准方法制备的兔抗hIL-10多克隆抗血清在4℃下温育过夜，并预吸附在蛋白质G树脂(Pierce Chemical Co.)上。每个样品含有20μl树脂。温育后，树脂用PBS洗涤三次，且再悬浮于20μl没有还原剂的SDS-PAGE缓冲液中。然后在非还原条件下取每种样品20μl在4-15%梯度凝胶(Daiichi Chemical Co.，Tokyo)中进行SDS-PAGE。平行进行一组预先染色分子量标记(Life Technologies，Inc.)来测定交联复合物的大小。电泳后干燥凝胶，在-80℃下用两个增感屏使凝胶与Kodak XAR胶片曝光48小时。
COS7转染在一电穿孔小池(Bio-Rad，Richmond，CA)中使5微克质粒DNA与250μl带有10%FBS和抗菌素的DMEM中的5×106个COS7细胞混合。用0.20kV的Bio-Rad Gene Pulser将细胞电穿孔，电容量为960μF，电阻为200欧姆。室温下10分钟后，将细胞转移到10cm具有10ml完全培养基的平皿中使其附着。
在37℃下过夜温育后，用只是没有血清的同样培养基代替上述培养基。两天以后，通过在带有4mM EDTA和0.03%NaN3的PBS中温育，从平皿上分离出细胞，收集细胞，用于结合实验。每个结合测定大约使用1×106个细胞。
实施例2具有FLAG序列的人和鼠IL-10融合蛋白质的制备用标准分子生物学技术制备编码融合蛋白质的核酸构建物。如在IL-10活性的生物测定中所测得的，FLAG序列被商业上可得到的抗体(IBI-Kodak，Rochester，NY)识别，并不明显干扰IL-10融合蛋白质与结合蛋白质的缔合作用。
实施例3cDNA文库的制备应用标准技术从对IL-10敏感的细胞系构建cDNA库。参见Super Script Plasmid System for cDNA Systems and Plasmid Cloning，Life Technologies，BRL，Gaithersburg，MD。使用BJABB人细胞系，正如应用鼠MC/9肥大细胞和J774巨噬细胞系。
实施例4表达增大数目的IL-10结合蛋白质转化过的细胞的富集用生物素化的荧光FLAG抗体为标记，对cDNA库转染的细胞进行FACS分类。使转化的细胞与抗体接触后，加入藻红蛋白-链霉抗生物素蛋白(PE-streptavidin)。然后用FACS分析标记过的细胞，收集表达最大量IL-10结合的细胞的3～5%。被选择的细胞用于构成cDNA文库，细胞的富集重复3次。因此发现IL-10能竞争与FLAG-IL-10结合。
用亲和力纯化，即淘洗(panning)，在用抗-FLAG抗体包被的平皿上选择表达IL-10结合蛋白质的细胞。这样被鉴定的细胞被进行多次循环的淘洗过程，其外源载体插入物被分离并鉴定。
实施例5编码IL-10结合蛋白质的核酸的鉴定用标准方法通过测序进一步鉴定源于人和鼠cDNA的被分离的插入物。
选择作用后大部分细胞具有较高的荧光密度，且通过与50倍过量的IL-10的竞争作用大大减弱了结合信号。
实施例6乳过氧化物酶标记的人IL-10的生物活性用乳过氧化物酶方法将纯化的CHO-衍生的hIL-10碘化至高比活性(100至200μCi/μg蛋白质)。
最初试图用IODO-GEN试剂(Pierce，Rockford，IL)标记CHO-衍生的hIL-10使得产生足够比活性的蛋白质被用于受体鉴定中。用乳过氧化物酶方法得到的碘化hIL-10与用IODO-GEN得到的相比具有大约高五倍的比活性。
为了测定该高比活性标记的hIL-10是否具有生物活性，用Thompson-Snipes等人(J.Exp.Med.173507(1991))的方法检测样品诱导MC/9细胞增生的能力。用50ng/ml浓度的每个样品，发现标记和未标记IL-10的估计活性分别是7.48×102和1.16×103单位/毫升。因此标记的IL-10保留了64%的生物活性。碘化的hIL-10的其它样品测定表明通常保留大于50%生物活性。
实施例7放射标记的hIL-10活性形式的二聚特性当通过葡聚糖G-75凝胶过滤柱时，标记的蛋白质混合物被分成三个不同的种类。发现这个分离过程对于减少结合靶细胞的本底是需要的。最大的一类是随洗脱体积洗出的高分子量形式。最小的一类是在最低分子量标准(13.7kDa)和染色标记溴酚兰之间洗脱。
与分子量标准进行比较表明第二洗脱组分大小大约为37kDa，与预定的hIL-10二聚体的分子量相符。第二组分的SDS-PAGE表明高分子量形式是作为分子量在43kDa和200kDa之间的聚集体跑带。在这些条件下迁移的第二组分大约是18kDa，而根本没有发现第三组分。与最大和第二组分相关的放射活性是可沉淀的TCA而与小组分相关的则不是。
实施例8放射性碘化的人IL-10与细胞受体的结合在发现放射性碘化的hIL-10具有生物活性的基础上，测定馏分样品与患者细胞系特异性结合的能力。MC/9细胞通过增生作用应答hIL-10，因此它们首先被用来测定hIL-10的结合特异性。当由G-75柱得到的三个馏分被用来做与MC/9结合实验时，只37kDa馏分而不是其它两个能与之高度结合;而且500倍摩尔过量的未标记IL-10蛋白质能阻碍大于90%的标记IL-10的结合。
为了确定hIL-10结合其受体的特异性，其它细胞因子以及抗hIL-10单克隆抗体被用来测验它们抑制碘化hIL-10与其细胞表面受体结合的能力。发现过量的hIL-10在与TF-1结合中能与标记的hIL-10竞争。相反，hIL-5、hIL-4、IFN-γ、GM-CSF和hIL-6在竞争中无效。
为进一步证实hIL-10与TF-1细胞的结合是特异性的，检验hIL-10和hIL-5的单克隆抗体阻碍碘化hIL-10与其受体结合的能力。产生的抗hIL-10的中和单克隆抗体抑制标记的hIL-10与TF-1细胞的结合，但抗人IL-5单克隆抗体却不抑制。
用多种不同细胞系结合实验表明，hIL-10能在不同程度上与大多数这些细胞系相结合。发现结合程度最高的是用鼠肥大细胞系MC/9和人B-淋巴瘤系JY。相对于JY和MC/9而言，TF-1(人红白血病细胞系)以及Ramos和BH5(人B-淋巴瘤系)显示了降低的结合水平。实验的人IL-10以相对低的水平结合其它被检测的细胞。与WEHI265.1(一种鼠单核细胞系)的结合实验也表明相对低的结合水平。
实施例9人IL-10结合细胞受体的亲和力为了测定结合亲和力和估计每个细胞中结合位点/受体的数目，用JY和M/9细胞绘制出了典型的饱和结合曲线。对于两种细胞系，最大的结合是在大约300至400pM标记的hIL-10。有代表性的结合数据的Scatchard分析给出斜率是1Kd的直线标图，对JY细胞系大约为150pM，对MC/9系为49pM。得到的B最大值代表配体结合细胞的最大浓度，于MC/9和JY细胞系分别为4.0pM和7.5pM。假设一个hIL-10二聚物配体分子结合一个受体，估计对于MC/9每个细胞大约有100个未被占据的受体，对于JY每个细胞有180个未被占据的受体。由几个独立的实验得出，人IL-10对于JY和MC/9细胞的结合亲和力是大约50至170pM，每个细胞中有100至300个未被占据的受体。
实施例10人和鼠IL-10受体结合的种特异性为了测定受体结合的种特异性，检测了鼠和人IL-10与标记的人IL-10竞争结合鼠和人细胞系的能力。因为大肠杆菌衍生的鼠科IL-10的比生物活性是人IL-10的60～70%，如用MC/9生物实验所测定的，因此校准了在竞争实验中人和鼠科IL-10的浓度。鼠和人IL-10两者都能阻碍标记的hIl-10与鼠MC/9系的结合。相反，人IL-10，而不是鼠IL-10能成功地与标记的hIL-10竞争和人B-淋巴瘤系JY的结合。
实施例11人IL-10与细胞受体化学交联后产生的多复合物为了估算hIL-10受体结合复合物的大小，使125I-hIL-10与JY和MC/9(ATCC CRL 1649)细胞相结合，并按如上所述用EDC处理细胞。由于两种细胞系中hIL-10受体的数目低，交联后用抗hIL-10多克隆抗血清免疫沉淀细胞裂解物来富集结合复合物。
按上文所述进行SDS-PAGE和放射自显影后，发现JY和MC/9细胞系两者都得到hIL-10-特异性结合复合物。由两种细胞系产生的结合复合物的主要形式具有大约97kDa的估算分子量。JY细胞，而不是MC/9细胞得到两个另外的带，其具有大约190和210kDa的估计分子量。
也发现一些小的带，其分子量在68和43kDa之间变化。他们可以是较大复合物的降解产物。交联的125I-hIL-10显示为在43和29kDa标记物之间迁移的带。在1000倍摩尔过量的未标记的hIL-10的存在下完全抑制交联复合物的生成。
实施例12结合人IL-10的特异性用人或鼠cDNA克隆转染COS7细胞，使其表达载体达72小时，并测验与放射性碘化的人IL-10的结合。与只有载体不同，被克隆的受体cDNA能授与COS细胞上的人IL-10以特异性结合能力。人和鼠克隆两者都能结合人IL-10。
实施例13人IL-10受体亚单位的可溶的和融合衍生物的制备在下面的实施例中公开了定义各种用作PCR的寡核苷酸引物的SEQ ID序号。因此根据序列表能发现这些引物的核苷酸序列。
下面用来描述本发明的融合衍生物是含有人IL-10受体细胞外功能区、人IL-4细胞内功能区和或者人IL-10或者人IL-4跨膜区的一种蛋白质。这样的构建物是有用的，例如，解释由相应细胞因子进行信号转导的机理。
为了有利于重组质粒克隆到大肠杆菌中和在被转染COS细胞中的高效表达，首先制备pSV.Sport载体(Life Technologies，Gaithersburg，MD)的一种衍生物。这是通过用含有来自质粒pDSRG(ATCC68233)的SRα启动子和SV40t抗原内含子的一个pstⅠ-HindⅢ(末端填充)片段取代含有来自pSV.Sport的SV40复制原点和早期启动子的一个PstⅠ-ClaⅠ(末端填充)片段来完成。所得质粒命名为pSR.Sport。
人IL-4受体的细胞内功能区(ⅠC)的重建下面将hIL-4的ⅠC分为两个独立的部分，两者结合形成ⅠC。以质粒pME18S-hIL-4R(ATCC68263)为模板，利用命名为C3632CC(SEQ ID NO5)和C3633CC(SEQ ID NO6)的引物通过PCR合成一个BamHⅠ-PstⅠ片段。通过静止突变将原Sau 3A位点转进BamHⅠ位点以利于克隆。用BamHⅠ和PstⅠ限制性酶切该片段，克隆入pUC19(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)，用DNA测序核实。
然后用PstⅠ处理质粒pME18S-hIL-4R以释放一个900bp PstⅠ-PstⅠ片段，该片段在如上文描述所修饰的质粒pUC19的PstⅠ位点被插入。用DNA测序核实含有完全人IL-4ⅠC的所得构建物。因此hIL-4ⅠC被重建为一BamHⅠ……PstⅠ……PstⅠ插入在pUC19中。
人IL-10受体细胞外功能区(EC)的重建通过两个限制性片段的连接完成EC的构建。在hIL-10受体亚单位(SEQ ID NO1)的346碱基处(甘氨酸95密码子的第三个碱基)通过静止突变产生一个KpnⅠ位点以利于克隆。通过PCR单独地合成5′和3′末端片段并克隆到pUC19中，分别为一个EcoRⅠ/SalⅠ…KpnⅠ片段和一个KpnⅠ…BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段。克隆SW8.1DNA(ATCC69146)被用作合成两个片段的模板。命名为C3628CC(SEQ ID NO7)和C3629CC(SEQ ID NO8)的引物被用来制备5′片段，而用C3630CC(SEQ ID NO9)和C3631CC(SEQ ID NO10)命名的引物被用来制备3′片段。
如下面所描述的，通过碱基757(SEQ ID NO1)的静止突变产生一个BstEⅡ位点。在EC末端加入一个终止密码子以进行可溶hIL-10受体的构建，该构建物作为一个EcoRⅠ-EcoRⅠ片段被克隆。
将KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段与EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ片段连接形成hIL-10R的EC，即一个EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段后，用DNA测序验证EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ和KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段。
跨膜功能区(TM)的重建用质粒pME18S-hIL-4R(ATCC68263;1990年3月20日保藏)为模板，且引物用C3634CC(SEQ ID NO11)和C3635CC(SEQ ID NO12)命名，通过PCR合成编码hIL-4R TM的DNA，为一个EcoRⅠ/BstEⅡ-BamHⅠ片段。引入静止性变化产生限制性位点，将TM克隆到pUC19后用DNA测序验证所得构建物。
全长嵌合受体DNA的装配从上文所描述的载体中切除hIL-4R ⅠC作为一个BamHⅠ-HindⅢ片段，并插入到已经含有hIL-10R EC的pUC19载体中。然后由hIL-4R合成的TM被插入到pUC19载体中作为一个BstEⅡ-BamHⅠ片段，以生成一个含有全长嵌合受体DNA的质粒。然后从该质粒上切除该DNA，作为SalⅠ……HindⅢ片段克隆到表达载体pSR.Sport中，且被表达生成嵌合受体。
可溶性人IL-10受体从载体中切下上文所述的EcoRⅠ/SalⅠ-KpnⅠ-BstEⅡ-Stop/EcoRⅠ/BamHⅠ片段作为一个EcoRⅠ……EcoRⅠ片段并克隆到pDSRG中用以直接转染，或切下作为一个EcoRⅠ末端填充的片段和SalⅠ片段并克隆到用SalⅠ/SnaBⅠ限制的pSR.Sport中用以与pDSRG共转染。
可溶性人IL-10受体的纯化和鉴定通过将用标准方法(参见U.S.Patent No.5231012，Mosmann et al)制备的hIL-10交联到N-羟基丁二酰胺酯活化的琼脂糖凝胶颗粒上构建人IL-10亲和柱。来自产生可溶受体的转染细胞的调理培养基被用于该柱。该柱然后装入2M MgCl2(pH7.5)以释放结合的可溶hIL-10受体，通过用银染色的SDS-PAGE分析洗脱产物。
观察到一组三个带，两大一小，表观分子量为大约43kKa。用借助标准方法制备的多克隆抗受体多肽(包括SEQ ID NO1的残基147-168)抗血清进行Western印迹分析表明这三个带对应于用银染色得到的带，说明都是hIL-10R相关的。用免疫前血清的对照实验来测得信号。
由于被推测的hIL-10受体蛋白质的氨基酸序列具有大量可能的N-糖基化位点，所以观察到的纯化受体蛋白质的复杂性可能是由于多变的糖基化作用。为了研究这种可能性，首先将洗脱产物渗析到PBS中，然后再用内聚糖酶F(N-glycanase)处理，并与未处理产物一起进行电泳和Western印迹分析。
在聚糖酶处理的样品中在大约43kDa的三个带作为一个具有表观分子重量大约为25kDa的带一起迁移，它具推测的未糖基化重组可溶性hIL-10受体的大小。另外，由亲和柱洗脱的产物的氨基末端测序显示了头15个氨基酸残基对应于由hIL-10受体DNA核苷酸序列推测的残基22～36(SEQ ID NO2)。因此，很明显纯化的可溶性受体的多肽骨架根据分子量大小而言是均一的。
序列表(1)一般情报(ⅰ)申请人(A)姓名Schering Corporation(B)街道One Giralda Farms(C)城市Madison(D)州New Jersey(E)国家U.S.A.
(F)邮编(ZIP)07940-1000(G)电话201-822-7375(H)传真201-822-7039(I)电传219165(ⅱ)发明题目哺乳动物的白细胞介素-10受体(ⅲ)序列数目12(ⅳ)计算机可读形式(A)介质类型Floppy盘(B)机型Apple Macintosh(C)操作系统Macintosh 6.0.8(D)软件Microsoft Word 5.1 a(ⅴ)目前申请数据(A)申请号(B)申请日(ⅵ)优先申请数据(A)申请号US 08/110683(B)申请日23-8-1993(ⅵ)优先申请数据(A)申请号US 08/011066(B)申请日29-1-1993(ⅵ)优先申请数据(A)申请号US 07/989792(B)申请日10-12-1992(2)SEQ ID NO1的情报
(ⅰ)序列特征(A)长度3632个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
(2)SEQ ID NO2(ⅰ)序列特征(A)长度578个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3(ⅰ)序列特征(A)长度3520碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4(ⅰ)序列特征(A)长度575个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
(2)SEQ ID NO5(ⅰ)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5ATGGTGGGAT CCGATTCCCA ACCCAGCCCG CAGCCGCCTC GT(2)SEQ ID NO6(ⅰ)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸
(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6ACGCTCAGCA CTG CAGCTGC CCCATGCTGG AGGACAT(2)SEQ ID NO7(ⅰ)序列特征(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7GCAGCGAATT CGTCGACGCC GCCACCATGC TGCCGTGCCT CGTAGTGTGCT(2)SEQ ID NO8(ⅰ)序列特征(A)长度46个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8CACTCTGGCT CACCGGTACC CATTGCTGTG GTACAGGTCC AAGGTC
(2)SEQ ID NO9(ⅰ)序列特征(A)长度43个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9GTACCACAGC AATGGGTACC GGGCCAGAGT GCGGGCTGTG GAC(2)SEQ ID NO10(ⅰ)序列特征(A)长度65个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10GCTTCAGTAG CTGGATCCGA ATTCTCAGTT GGTCACCGTG AAATACTGCCTGGTGAGGGA GATGC(2)SEQ ID NO11(ⅰ)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链单链
(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11GAATTCGTGA GGTGACCAAC CTCCTGCTGG GCGTCAGCGT TTCCTGC(2)SEQ ID NO12(ⅰ)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12GCTCGACGAT GGATCCCACC ATTCTTTCTT AATCTTGGTG ATGC
权利要求
1.一种被分离的核酸，编码哺乳动物IL-10受体蛋白质或其片段。
2.一种被分离的核酸，其在严格条件下与保藏于美国典型培养物保藏中心登记号为ATCC69146或69147的质粒杂交。
3.一种权利要求1或2的核酸，其编码特异性结合IL-10的受体蛋白质或片段。
4.一种含有权利要求1至3中任何一个权利要求的核酸的重组载体。
5.权利要求1至4的任一权利要求的核酸或重组载体，其中所说的核酸编码人或鼠IL-10受体蛋白质或片段。
6.权利要求1至5的任一权利要求的核酸或重组载体，其中所说的核酸编码可溶形式的人IL-10受体蛋白质。
7.权利要求5的核酸或重组载体，其中，该核酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3定义的核苷酸序列，或者由于遗传密码的简并性，该核酸是这两个序列中每一个的功能等价物。
8.一种含有权利要求4至7任一权利要求的重组载体的宿主细胞。
9.一种制备哺乳动物IL-10受体蛋白质或其片段的方法，包括在核酸被表达的条件下培养权利要求8的宿主细胞。
10.一种被分离的、特异性结合IL-10的哺乳动物受体蛋白质或片段。
11.权利要求10的受体蛋白质或片段，它是一种人或鼠IL-10受体蛋白质或片段。
12.权利要求11的受体蛋白质，其具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4定义的氨基酸序列。
13.权利要求10或11的片段，它是一种可溶形式的人IL-10受体蛋白质。
14.一种嵌合的受体蛋白质，包括人IL-10受体细胞外功能区和人IL-4受体细胞内功能区。
15.一种抗权利要求10至14任一权利要求中的受体蛋白质或片段的抗体或其结合片段。
16.权利要求15的抗体或结合片段，其是一个单克隆抗体或结合片段。
17.一种拮抗IL-10生物活性的药物组合物，含有一种药学上可接受的载体和权利要求15或16中的一种可溶形式的人IL-10受体蛋白质或一种抗体或结合片段。
18.一种制备拮抗IL-10生物活性的药物组合物的方法，包括将一种药学上可接受的载体与权利要求15或16中的一种可溶性形式的人IL-10受体蛋白质或一种抗体或结合片段进行混合。
19.一种含有一种容器的药盒，所述容器中含有权利要求1至3、10至13、15或16中任一权利要求中的一种核酸、受体蛋白质或其片段或抗体或其结合片段。
全文摘要
本发明提供了哺乳动物IL-10受体亚单位，以及编码所说亚单位的各种变异体的核酸。也提供了该核酸和受体亚单位的应用，包括筛选该受体配体的拮抗剂或兴奋剂的方法，制备诊断或治疗试剂的方法和制备抗体的方法。也提供了治疗或诊断试剂和药盒。
文档编号A61P31/04GK1090326SQ9312168
公开日1994年8月3日 申请日期1993年12月10日 优先权日1992年12月10日
发明者K·W·穆尔, 刘 英, 何淑榆, 徐迪惠, J·C·陈, 周传初, J·F·巴桑 申请人:先灵公司