专利名称：：使用锶盐生产药物组合物用以治疗关节病的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用锶盐生产药物组合物以用来预防和治疗关节病。以治疗为目的使用锶盐是许多出版物和专利的主题。例如专利US-A-4152431描述了能用于治疗炎症的碱金属盐。专利WO-A-94/09798提出有治疗皮肤疾病效力的各种金属硫酸盐配合物。OlleSvensson等人的文章(ActaPath.Microbiol.immunol.，Scand.，Sect.A，93，(1985)，115-120)表明锶盐在某些佝偻病例中起了作用。本申请人现已发现无机或有机形式的锶盐有明显的药物学性质并发现用于治疗中，在预防和治疗关节病中具有十分彻底的疗效。实际上已经发现了锶盐通过人体软骨细胞促进蛋白多糖和(II)型胶原蛋白的合成。这些分子是细胞外软骨组织层的二个主要成分。细胞外软骨组织床是以纤维胶原蛋白网外壳包裹高浓度蛋白多糖结合体，纤维胶原蛋白网给予组织以机械性能。由于蛋白多糖的合成和分泌随年龄而减少，因而锶盐在预防和治疗关节病方面具有重大的作用。锶盐在发生于疾病起始阶段的修复过程期间有特别的作用。本发明涉及使用有机酸或无机酸的二价锶盐来制备药物组合物，预期用于预防和治疗关节病。在为获得本发明的锶盐而使用的成盐无机酸中，可以更具体地指出的有盐酸、硫酸、硝酸、碳酸和磷酸。在为获得本发明的锶盐而使用的成盐有机酸中，可以更具体地指出的有酒石酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸、葡糖酸、草酸、乳酸、琥珀酸、甲磺酸、乙磺酸、樟脑酸和柠檬酸以及2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸。通过列举不具备限制性的例子，本发明涉及使用下列本发明的锶盐1.2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸的二锶盐，2.柠檬酸锶，3.樟脑酸锶，4.乙磺酸锶，5.甲磺酸锶，6.琥珀酸锶，7.乳酸锶，8.草酸锶，9.葡糖酸锶，10.富马酸锶，11.丙二酸锶，12.马来酸锶，13.苹果酸锶，14.酒石酸锶，15.磷酸锶，16.碳酸锶，17.硝酸锶，18.硫酸锶，19.氯化锶。本发明优选的锶盐是2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸的二锶盐，在专利EP-B-0415850中描述了这种锶盐的抗骨质疏松的性质和在治疗皮肤和血管老化中的应用，在治疗肝病和在治疗牙齿疾病中的应用。关节病从解剖学上看是以关节软骨组织初始和原发的损坏为特征的。在正常的情况下，软骨组织更新是一个非常缓慢的包括由软骨细胞吸回阶段的过程，吸回阶段是通过一个形成阶段对同样的这些软骨细胞的直接代偿。在病理的情况下，软骨组织的更新可能加快，导致一种伴随细胞代偿失调和软骨组织损坏的早期软骨组织修复反应。该修复反应来源于软骨细胞的克隆倍增以及软骨组织基质成分的合成的增加(D.Hamerman等人，N.Eng.J.Med.，(1989)，320(20)，1322-1330)。这种体内平衡反应不适应而又取决于随年龄而减少的全身激素和生长因子的分泌。软骨组织的吸回作用受到由邻近组织产生的酶和游离基的调节，但也特别受到软骨细胞自身产生的酶和游离基的调节。所以最特别有利的是使药物组合物能够对软骨细胞代谢起作用，既对软骨的形成起作用也对软骨的吸回起作用。这些药物组合物将以合适的用药形式提供，通过口服、非肠道给药、经皮肤给药、鼻给药、直肠给药或perlingual路线给药，尤其是以注射溶液、片剂、舌下含片、glossettes、胶凝体胶囊、胶囊、锭剂、栓剂、乳膏、油膏、skingels等形式提供。除了锶盐之外，这些本发明的药物组合物含有一种或多种选自下列的赋形剂或赋形药稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂、吸收剂、稀释剂、着色剂、增甜剂等。对于非限制性的例子，可以指出的有●用作稀释剂乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、甘油，●用作润滑剂二氧化硅、滑石、硬脂酸和其镁和钙盐、聚乙二醇，●用作粘合剂硅酸铝和镁、淀粉、明胶、黄耆质、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮，●用作崩解剂琼脂、藻酸和其钠盐、起泡混合物。所使用的剂量根据病人的性别、年龄和体重、用药的方式、与其相关的病况和治疗的性质而变化，每24小时在25mg～3g的锶之间，例如，每24小时在100mg和2g的锶之间。以下的实施例说明本发明但决不限制本发明。药物学研究实施例A研究本发明的锶盐对于软骨细胞的代谢作用A)工艺a)人的软骨细胞的培养软骨细胞要在短时间内培养以便保存其表现型。按照这种方法，软骨组织是从刚刚死去的人尸体的膝盖处取下来的。避开骨化层，把表皮层和正中层切除下来。软骨组织被切成小块然后进行酶消化作业。这些软骨组织切块再用透明质酸酶、链链霉蛋白酶和胶原酶连续处理。首先，这些软骨组织切块用预先溶解在Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM，ICNBiomedical)(0.5mg/ml；每10ml酶溶液3g软骨组织)中的透明质酸酶，在37℃和不停的搅拌下(200rpm)培养30分钟。其次，将上述软骨组织切块放置在链霉蛋白酶溶液(1mg/ml，在DMEM中；每10ml酶溶液3g软骨组织)中并且在37℃用这种酶培养一小时。然后将该软骨组织切块用溶解在含1％UltrosserG，(Gibco，Gand，Belgium)MDEM中的胶原酶(1mg/ml，每10ml酶溶液3g软骨组织)在37℃并在不停的搅拌下(200rpm)培养20小时。其细胞用尼龙薄纱(孔径25微米)过滤，水洗3次，计数(数目范围1×106-5×106细胞/ml，取决于研究的范围)，然后再悬浮置于适合的培养基中。然后将这些细胞在一个gyratory搅拌器(100rpm)中在95％空气和5％二氧化碳气的气氛下通过不停的搅拌保持呈悬浮态。将这些细胞与上清液用离心机(1000rpm，5分钟)分离。细胞团块和上清液在-20℃贮藏。b)软骨细胞培养基的处理在被试验的锶盐不存在或存在的条件下，以10-4M、5×10-4M和10-3M的浓度按照24、48和72小时培养软骨细胞(±1.5×106-5×106细胞/ml)。对于每种被试验的化合物浓度和其相应的对比试验，每批使用3个培养皿。每个培养皿含有±1-1.5×106软骨细胞。这些试验用二个不同的给体重复进行二次。测定在上清液和在细胞相中的蛋白多糖和(II)型胶原蛋白。c)各参数的研究1.软骨形成的参数在DMEM中外加1％ITS+抗坏血酸(50μg/ml)进行培养。ITS+含有6.25μg/ml的胰岛素，625μg/ml铁传递蛋白，6.25μg/ml的硒，1.25mg/ml的牛血清清蛋白和535μg/ml亚油酸。蛋白多糖和II型胶原蛋白在预先加有蛋白酶抑制剂的上清液中直接进行化检。在测定前，细胞聚集体采用超声波分离法(每10秒3批脉冲)在含有蛋白酶抑制剂的PBS中匀化。在这个研究中所使用的蛋白酶抑制剂是6-氨基己酸(0.1M)，盐酸苯甲脒(0.05M)，一种胰蛋白酶抑制剂(5×10-8M)，EDTA(0.01M)和硝酸钠(6.7×10-3M)。*蛋白多糖的放射免疫测定法(RIA)释放到培养基(CM)中的和在软骨细胞聚集体(CA)中的蛋白多糖按照P.Gysen和P.Franchimont(J.Immunoassay，(1984)，5，221-243)所描述的方法测定。RIA分析的敏感度是0.6ng/试管。在测定曲线的直线段，内和外测定系数的偏差分别小于10和20％。抗体只是针对蛋白核的抗原因子。在CM和CA中的蛋白多糖之和相当于该分子的总产量。*硫酸葡糖氨基聚糖酯的合成这个方法通过加入35SO4来测定硫酸葡糖氨基聚糖酯产量。用锶盐处理的软骨细胞在Na235SO4的参与下培养24小时。采用离心分离法分离出细胞并漂洗。在蛋白酶的参与下把在培养基中的和在细胞中的葡糖氨基聚糖提取出来。在24小时的培养期间硫酸葡糖氨基聚糖酯总的产量用放射性计数测定。提取物采用SepharoseCL2B(琼脂糖)色谱法测定以便研究其理化结构。*II型胶原蛋白的放射免疫测定(RIA)被释放到培养液中的和在细胞相中的II型胶原蛋白按照H.Henrotin等人(J.Immunoassay，(1990)，11，555-578)所描述的方法测定。该测定的检验极限是3ng/试管。在测定曲线的直线段，内和外测定系数的偏差分别是8和15％。抗体是射向天然分子的螺旋形部分。2.软骨吸回参数培养在外加1％TS+和抗坏血酸(50μg/ml)的DMEM中进行。TS+含有625μg/ml铁传递蛋白，6.25μg/ml的硒，1.25μg/ml的牛血清清蛋白和535μg/ml亚油酸。蛋白多糖和II型胶原蛋白在预先加有蛋白酶抑制剂的上清液中直接进行检验。在测定前，细胞聚集体采用超声波分离法(每10秒3批脉冲)在含有蛋白酶抑制剂的PBS中匀化。*stromelysine活性的分析使用从牛奶获得的示踪试卤灵-酪蛋白分析酪蛋白降解活性(boehringerMannheim)。在这个研究中，潜在的stromelysine的激活是通过加入最后浓度为2mM的APMA(对-氨基苯基乙酸汞)(SigmaChemie，Deinsenhofen，德国)产生的。软骨细胞被调节的培养基在37℃培养4小时。在含有0.02M氯化钙的滴定过的一种缓冲溶液(0.2M三-HCl；pH＝7.8)中，以20μg的示踪试卤灵-酪蛋白在37℃把激活的培养基培养18小时。在这次培养之后，通过加入最后浓度为1.6％的三氯乙酸停止这个酶反应。试样以7000rpm离心分离15分钟。在这些条件下，未裂开的酪蛋白完全沉淀下来，而在上清液中仍然留有95％的裂开的酪蛋白。采用荧光法进行测定。激发波长是574nm而发射波长是584nm。通过培养大量的纯化stromelysine得到标准曲线。并行地，含有在培养之前加入10mMEDTA的试样采用相同的方式处理，对比值是从所获得的值中减去后给该活性培养基提供对比值。该对比值从来不超过在活性培养基中测量的荧光的5％。所有的测定都进行二次。B)结果结果以每μg的DNA释放到培养基中的和存在于细胞相中的蛋白多糖和II型胶原蛋白的比表示。计算出平均值±平均值的标准偏差。在各组之间的比较使用非-配对研究员的t试验(non-pairedStudent’sttest)；当p＜0.05时从统计学上看其差值是很显著的。1.软骨形成的参数*蛋白多糖的放射免疫测定法(RIA)以下的结果表示在24、48和72小时培养后，在不同的浓度下的2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸的二锶盐对于蛋白多糖的(培养基+细胞相)总产量的作用。</tables>*平均值±标准偏差**NS＝不明显在附录I的图中以矩形图的形式表示这些结果。*硫酸葡糖氨基聚糖酯的生成采用第二种方法进一步证实了2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧基酸的二锶盐(化合物A)对于软骨细胞的合成的作用，并且表明氯化锶表现出同样的作用，这些作用显示锶盐通过人的软骨细胞对软骨形成起促进作用。</tables>使用二种锶盐得到的色谱曲线，尤其是使用化合物A得到的色谱曲线显示高分子量的葡糖氨基聚糖合成增加。下表列出了合成的软骨组织根据其分子量的分布情况(％)。</tables>*II型胶原蛋白的放射免疫测定(RIA)以下的结果表示在24、48和72小时培养后，在不同的浓度下的(化合物A)酸的二锶盐对于释放到培养基中的II型胶原蛋白的产量的作用。</tables>*平均值±标准偏差**NS＝不明显在附录II的图中以矩形图的形式表示这些结果。2.软骨吸回参数*stromelysine活性的分析以下的结果表示在24、48和72小时培养后，在不同的浓度下的2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧基酸的二锶盐对于stromelysine产量的作用。</tables>*平均值±标准偏差**NS＝不明显实施例B药物组合物片剂该片剂含有500mg剂量的2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸的二锶盐，即170mg的锶。每1000片的配方2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧基酸的二锶盐—500mg(即170mg的锶)小麦淀粉--------------------------------------1000g乳糖------------------------------------------800g硬脂酸镁--------------------------------------50g二氧化硅--------------------------------------20g羟丙基纤维素----------------------------------50g权利要求1.使用锶盐生产药物组合物用以预防和治疗关节炎。2.如权利要求1所述的2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸的二锶盐的使用。3.用于预防和治疗关节病的药物组合物，含有如权利要求1所述的一种锶盐，单独使用或与一种或多种惰性的、非毒性的并且是药物学可接受的赋形剂或载体混合使用。4.如权利要求3所述的药物组合物，含有2-[N，N-二(羧甲基)氨基]-3-氰基-4-羧甲基噻吩-5-羧酸的二锶盐，单独使用或与一种或多种惰性的、非毒性的并且是药物学可接受的赋形剂或载体混合使用。5.如权利要求1所述的氯化锶的使用。6.如权利要求3所述的药物组合物，含有氯化锶，单独使用或与一种或多种惰性的、非毒性的并且是药物学可接受的赋形剂或载体混合使用。全文摘要本发明涉及使用锶盐生产药物组合物以期用来预防和治疗关节炎。文档编号A61P19/02GK1179944SQ97114908公开日1998年4月29日申请日期1997年6月16日优先权日1996年6月17日发明者Y·特所德罗斯,P·德罗夫,M·威茨比吉申请人:阿迪尔公司