r>[0217] 使用复合物I免疫捕获试剂盒（MitoSciences)对新制备的线粒体进行复合物I 的免疫沉淀。免疫沉淀后，使用SDS缓冲剂洗脱结合蛋白并且随后使用SDS-PAGE和Western 印迹分析。
[0218] 呼吸链复合物和超复合物的分离
[0219] 在补加 Mini Protase抑制剂的PBS中悬浮新分离的非冷冻线粒体小颗粒。将线粒 体在5000 Xg下制粒5分钟，随后溶解为MB2缓冲液（I. 75M氨基己酸，7. 5mM的Bis-Tris pH7.0+2mMEGTApH8.0)至5mg/ml的浓度。用0.5%毛地黄皂苷在冰上孵育5分钟溶解 线粒体膜蛋白。在13000Xg离心样品30分钟，收集上清液，如前述测定蛋白浓度。最后， 加入SBG(750mM氨基己酸，5% Serva Blue G)至4. 5%的最终浓度。
[0220] 蓝绿温和 PAGE，SDS-PAGE (Blue native PAGE，SDS-PAGE)以及 Western 印迹
[0221] 在BN-PAGE 4-16 % Bis-Tris的凝胶上分离5 μ g线粒体膜蛋白，该凝胶用考马斯 亮蓝染色或使用 Iblot 设备（Invitrogen Inc.)印迹至 PVDF 膜上（Immobilon, Millipor e，Bedford, MA，USA)。在12% SDS-PAGE上分离复合物I-免疫沉淀的蛋白并且转移至PVDF 膜上。在4°C过夜阻断后，用抗复合物I(Sigma)的亚基UFVl或鼠 AlM抗体孵育。通过用 HRP-结合的羊抗鼠（DAKO)或羊抗兔（DAKO)孵育检测主要的抗体。
[0222] 透射电子显微镜检查（TEM)
[0223] 人角质化细胞（约1百万个细胞），在室温下用20μ M血红素（有或无10μ M的 AIM)孵育20小时，通过离心制粒，并随后在室温固定1小时，然后在2. 5%戊二醛的0. 15Μ 的二甲胂酸钠，pH7.4(二甲胂缓冲液）溶液中4°C过夜。然后样品用二甲胂酸盐缓冲液洗 涤并且在室温1 %的四氧化锇的二甲胂酸盐缓冲液中后-固定1小时，在渐变的一系列乙醇 中脱水，并使用丙酮作为中间溶剂再嵌入环氧树脂812。LKB超薄切片机上用金刚石刀将样 品切成50-70nm厚的超薄切片。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。在80kV加速电压 下操作的JE0LJEM1230型电子显微镜中观察样品。用Gatan Multiscan 791CCD照相机记 录图像。如先前所述（迎）进行具有金标记的抗A1M(BN11. 3)的薄切片的免疫标记，不同的 是使用Aurion-BSA作为阻断剂。最后用醋酸铀和柠檬酸铅染色，并且在80kV的加速电压 下运行的Jeol JEM1230电子显微镜中观察。用Gatan Multiscan791电荷耦合器件照相机 记录图像。
[0224] ATP 分析
[0225] 基于荧光素酶的ATP依赖活性，使用发光检测试剂盒（Promega，Madison, WI)测量 细胞ATP生产。ATP水平标准化为相应的样本蛋白含量。
[0226] 统计分析
[0227] 使用Origin 8软件进行统计分析。使用student^ s t检验进行统计评估并且当 P〈0. 05时认为是显著的。
[0228] 结果
[0229] AlM特异性结合至受损细胞
[0230] 通过流式细胞术分析AlM至凋亡细胞和健康细胞的结合，并且与未处理的细胞对 t匕。首先，通过交联⑶3分子与固定化的抗小鼠⑶3抗体（图IA中的E)或者通过用5 %乙 醇或10 %的DMSO (图1B)孵育诱导鼠 T细胞杂交瘤（HCQ. 4)凋亡。这些处理导致DAN破 碎并且在15至18小时后摄入台盼蓝（未示出）。可以检测到AlM与未处理细胞的弱的结 合（图1A，左面）。可以检测到与抗-CD3交联（图1A，右图）交联或用乙醇或DMSO处理 的细胞的另外的更强的结合。该结合可以与PI摄入相关，即只有可以结合PI的细胞表现 出AlM的更强结合（图1B)。鼠前B细胞系（使用药物3-CPA诱导凋亡，并用AlM随后用抗 AlM孵育）的流式细胞术显示出了类似的结果（图1C)，这表明与凋亡细胞的结合并不限于 T细胞。
[0231] 为了进一步表征AlM至受损细胞的结合，使用人红细胞系K562(图1D)研究该结 合以及早幼粒细胞系HL60 (未示出）通过加入血红素诱导凋亡并且用Α1Μ，随后用抗AlM孵 育。如图中所示，可见两种不同类型的染色，对大部分细胞的细胞表面的弱颗粒染色和对细 胞的一小部分（约6% )更显著的细胞内的均匀染色。HL60细胞（未示出）可获得相似的 结果。这些结果表明AlM至凋亡细胞的强结合主要是细胞内，其通过共聚焦显微镜检查可 以确定（见下面，图3Α)。
[0232] 为了研究结合的特异性，可以对HCQ.4细胞（通过⑶3交联诱导至凋亡）进行竞 争性细胞结合试验，并且将其与正常的未处理细胞对比。将 125I标记的AlM和过量的未标记 的AIM、卵白蛋白、BSA或AGP加入至细胞（图1Ε)。相比未处理的细胞（右），更多的AlM 结合至凋亡细胞（图1E，左）。对于凋亡细胞以及对于未处理细胞，过量的未标记的AlM阻 碍125I-AlM结合至相同的基础水平。发现该下降是显著的（p〈0. 001)。未标记的对照蛋白 并没有显著降低125I-AlM至未处理细胞的结合，从而表明AlM的特异性结合。对于凋亡细 胞，通过对照蛋白存在少量的显著的下降（P〈〇. 05)。该少量的下降可能是由于增加的非特 异性背景（unspecific background)(结合至暴露的细胞内结构）。因此，该结果表明AlM 与凋亡细胞的非特异性更强的结合。从斯卡查德图可以确定对于AlM结合至凋亡的HCQ. 4 细胞的亲和常数为lx IO6M'根据台盼蓝排除法（未示出）这些细胞的活性为25%。
[0233] 如上面提及的，该AlM-结合的细胞内化PI (图1B)。这表明细胞膜开始渗漏后，在 凋亡过程的后期发生AlM结合。为证实该结果，进行AlM至HCQ. 4细胞（通过抗-⑶3交联 诱导至凋亡）结合的时间研究。在诱导之后的不同时间点采集的样品的流式细胞术表明PI 摄入在AlM结合之前（图2A)。未发现与对于PI摄入呈阴性的细胞明显的结合关联。当用 AIM、膜联蛋白V(细胞凋亡标记物）和7AAD(细胞膜的通透性标记物染料）三重染色鼠前 B细胞时，获得相同的结果（图2B)。只有7AAD阳性细胞表现出强的AlM结合，而对于膜联 蛋白V而不是7AAD阳性的细胞并未结合AIM。
[0234] 细胞内AIM-结合蛋白的识别
[0235] 为了寻找与AlM相互作用的细胞蛋白，使用酵母双杂交系统。在人白细胞文库中 使用编码AlM的cDNA作为诱饵以寻找AlM-相互作用的蛋白。对于报告基因激活，分析了约 2x IO6个转化体。在缺乏组氨酸的平板上总共存活了 168个菌落，其中13个对于β半乳糖 苷酶也呈阳性。分离His+LacZ+重组文库质粒并且在具有诱饵质粒（仅编码诱饵蛋白以及 与不相关蛋白融合的蛋白）的直接2-杂交试验中测试。表明11个重组质粒编码与AlM相 互作用，但不与诱饵蛋白或融合至它的其他不相关蛋白相互作用的蛋白。在线粒体复合物 I中，插入物的DNA序列揭示，它们中的7个是SDAP亚基的截尾形式（NDUFAB1) (truncated form)，一个是相同亚基的全序列，一个是snRNA结合蛋白，一个是N-乙酰葡糖胺激酶以及 一个是结肠癌抗原。所有的插入物都在祀载体（prey vector)的框中（表1)。
[0236] 表1.在酵母双杂交系统中发现AlM相互作用的蛋白。
【主权项】
1. a 1-微球蛋白，用于在治疗线粒体相关的疾病中使用。 2. a 1-微球蛋白，用于在修复、恢复或维持线粒体功能中使用。 3. a 1-微球蛋白，用于在预防或治疗药物诱导的线粒体相关的副作用中使用。 4. a 1-微球蛋白，用于在预防或治疗环境诱导的线粒体相关的作用中使用。 5. a 1-微球蛋白，用于在治疗或防治线粒体相关的疾病或奈乱中使用，其中，所述疾病 或奈乱是本文所描述的。
6. 根据前述权利要求中任一项使用的a 1-微球蛋白，其中，所述线粒体相关的疾病或 奈乱、所述药物诱导的线粒体相关的负作用或所述环境诱导的线粒体相关的作用是W下清 单的疾病或奈乱中的一种或多种、或W下清单的疾病或奈乱的选择： ?阿尔佩斯病（进行性婴儿脑灰质营养不良） ?己特综合症（致死性婴幼儿也肌病） ?目-氧化缺陷 ?也肌病 ?肉碱-醜基肉碱缺乏 ?肉碱缺乏 ?肌酸缺乏综合症（脑肌酸缺乏综合症（CCD巧，包括：己酸脈甲基转移酶缺乏佑AMT缺 乏）、k精氨酸：甘氨酸脉基转移酶缺乏（AGAT缺乏），W及化C6A8相关肌酸转运蛋白缺 乏（SLC6A8缺乏）。 ?辅酶Q10缺乏 ?复合物I缺乏（NADH脱氨酶（NADH-辅酶Q还原酶）缺乏） ?复合物II缺乏（玻巧酸脱氨酶缺乏） ?复合物III缺乏（泛酿细胞色素C氧化还原酶缺乏） ?复合物IV缺乏/COX缺乏（细胞色素C氧化酶缺乏是由呼吸链复合物IV缺陷造成 的） ?复合物V缺乏（ATP合成酶缺乏） ? COX缺乏 ? CPEO (慢性进行性外侧眼肌麻瘍综合症） ? CPT I缺乏 ? CPT II缺乏 ?弗里德赖希共济失调（FRDA或FA) ?脑肌病 ?戊二酸尿症II型 ? KSS (卡恩斯-塞尔综合症） ?乳酸性酸中毒 ? LCAD (长链醜基辅酶A脱氨酶缺陷） ? LCHAD ? Lei曲病或综合症（亚急性坏死性脑脊髓病） ? LHON (Leber遗传性视神经病） ?勒夫特病 ? MCAD (中链醜基辅酶A脱氨酶缺乏） ? MELAS (线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样发作） ? MERRF (肌阵李性癒痛伴碎红纤维病） ? MIRAS (线粒体隐性共济失调综合症） ?线粒体细胞病 ?线粒体DNA缺失 ?线粒体脑病包括；脑肌病、脑脊髓病 ?线粒体肌病 ? MNGIE (肌神经胃肠奈乱及脑病） ? NARP (神经病、共济失调和色素性视网膜炎） ?皮尔逊综合症 ?丙丽酸駿化酶缺乏 ?丙丽酸脱氨酶缺乏 ? POLG突变 ?呼吸链缺乏 ? SCAD (短链醜基辅酶A脱氨酶缺乏） ? SCHAD ?化CAD (极长链醜基辅酶A脱氨酶缺乏）。
7. 根据前述权利要求中任一项使用的a 1-微球蛋白，用于治疗或防治呼吸链奈乱。
8. 根据权利要求7使用的a 1-微球蛋白，其中，所述呼吸链奈乱涉及复合物I、II、 III、IV或V缺陷。
9. 根据前述权利要求中任一项使用的a 1-微球蛋白，用于治疗或防治儿童或青少年 的线粒体功能障碍。
10. 根据前述权利要求中任一项使用的a 1-微球蛋白，用于治疗或防治阿尔佩斯病、 己特综合症、弗里德赖希共济失调、KSS、Lei曲病或综合症、L册N、MELAS、MERRF、MIRAS和 NARP。
11. 根据前述权利要求中任一项使用的a 1-微球蛋白，用于治疗或防治女性线粒体功 能障碍。
12. 根据前述权利要求中任一项使用的a 1-微球蛋白，用于治疗或防治视网膜的损伤 或功能障碍或者与线粒体缺陷或功能障碍相关的眼部疾病。
13. -种用于治疗患有W下一种或多种的患者的方法：线粒体缺陷、线粒体相关的疾 病或奈乱、药物诱导的线粒体相关的副作用或环境诱导的线粒体相关的作用，所述方法包 括给予所述受试者a 1-微球蛋白。
14. 一种用于预防W下一种或多种的方法：线粒体缺陷、线粒体相关的疾病或奈乱、药 物诱导的线粒体相关的副作用或环境诱导的线粒体相关的作用。
15. 根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述受试者是包括人的哺乳动物。
16. 根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中，所述线粒体相关的疾病或奈乱如 权利要求5至12中任一项所描述的。
【专利摘要】本发明涉及用于治疗线粒体相关的疾病的α1-微球蛋白。
【IPC分类】A61K38-17, A61K38-00, A61P43-00
【公开号】CN104661673
【申请号】CN201380043567
【发明人】布·阿克斯特罗姆, 芒努斯·格拉姆, 莱娜·罗森勒夫
【申请人】A1M制药公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年9月4日
【公告号】CA2881321A1, EP2900254A1, US20150258171, WO2014037390A1