一种制备流感疫苗脂质体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种制备流感疫苗脂质体的方法。
【背景技术】
[0002] 佐剂是先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异 性免疫应答，而本身并不引起机体产生免疫应答的物质。理想的佐剂应具备以下特征：既能 促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，且不引起有害副作用，能用于不同 的抗原，能以不同途径免疫，能有效影响免疫反应质量，能在免疫抑制个体中发挥作用，稳 定、廉价和易生产。
[0003] 脂质体具有良好的免疫佐剂功能，可增强机体的体液免疫和细胞免疫。脂质体作 为疫苗佐剂具有以下优点：安全性好、副作用小、天然靶向性、可作为半抗原的载体诱发半 抗原特异性免疫应答，减少抗原的剂量及接种次数，能降低被包裹抗原的毒性，增强动物耐 受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力，提高抗原稳定性，延长疫苗使用期，降低储存条 件，比单用游离抗原或其他佐剂能显著地诱生抗体形成细胞，增加循环抗体滴度，并能强烈 地诱导免疫记忆细胞的形成，增强免疫记忆力。
[0004] 制备脂质体最基本和应用最广泛的方法是薄膜分散法，该法工艺简单，是制备蛋 白质药物脂质体的首选，利于规模化生产。鲁卫东等曾系统研宄了薄膜分散法制备流感疫 苗脂质体体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫的效果，结果显示免疫原性均有明显提高。但薄膜 分散法在制备过程中温度较高，不适用于减毒活疫苗脂质体的制备。薄膜分散法在37°c下 制备，适用于大多数疫苗的制备，但对某些对温度非常敏感的需要低温制备的疫苗，如减毒 活疫苗，则需要在更低的温度下制备。
[0005] 冻融法（freeze-thawing method)制备脂质体是先采用薄膜分散法和超声法制备 未载药的单层脂质体，冷冻前将待包封的药物加入，在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成， 使脂质体膜破裂，形成冰晶片层与破裂的脂膜共存状态，脂质和药物紧密接触，在缓慢融化 时，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体，并在此时实现对药物的包封。通过反复多次的 冻融，最终实现对药物的有效包封。
[0006] 冻融-冻干法是在薄膜分散法基础上进行的，分为：1)薄膜分散法成膜、2)水化形 成大多室脂质体、3)超声破碎形成大小均一的小单室脂质体，以及4)冻融法包封药物四个 过程。制备过程中药物性质、制备方法、大豆卵磷脂与胆固醇的比例、水和介质（PBS)溶液 的PH值、投药量、水合介质（PBS)的用量、所用有机试剂的种类及用量、薄膜分散法中水化 温度、旋转蒸发仪的旋转速度、水化时间长短、超声功率及频率、冻融次数等对脂质体的形 成和包封率均有影响。由于前期的试验已形成一套成熟的薄膜分散法成膜及水化形成大多 室脂质体的技术，因此本发明着重对超声破碎形成大小均一的小单室脂质体以及冻融法包 封药物过程中影响药物质量的因素进行限定，主要包括投药量、水合介质（PBS)的用量、超 声功率及频率、冻融次数四个因素。其余因素结合以前研宄确定为（1)水化转速：65r/min、 (2)水化时间：45min、（3)有机溶剂：无水乙醇、（4)磷脂种类：大豆卵磷脂、（5)PBS缓冲 液pH值：7. 0、（6)磷脂胆固醇比：300:100 (mg)。
[0007] 运用冻融-冻干法制备脂质体，得到具有一定外形的粉状或饼状物，以固体形式 存在，能够在保证安全性的基础上提高流感疫苗的稳定性，便于疫苗的运输与保存，避免了 磷脂和药物的水解、药物泄露等问题的出现，能够满足更多生物制品脂质体低温制备的特 殊要求。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是克服原有的脂质体制备方法制备过程中温度较高，无 法用于某些对温度非常敏感的需要低温制备的疫苗，其目的是提供一种可在低温条件下制 备流感疫苗脂质体的方法：冻融-冻干法。
[0009] 为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
[0010] 一种制备流感疫苗脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0011] ⑴磷脂膜的制备
[0012] 将大豆卵磷脂300mg和胆固醇IOOmg混合溶于15ml无水乙醇后，于37°C减压旋转 蒸发，除去无水乙醇溶剂，得磷脂膜；
[0013] (2)空白脂质体的制备
[0014] ①在磷脂膜中加入25ml~35ml pH为7. 0的磷酸盐缓冲液，在磷脂的液晶相转变 温度（Tc) 50°C以上进行水浴旋转水化lh，得混悬液；
[0015] ②所得混悬液在50°C以上放置1~2h，得空白脂质体；
[0016] (3)制备单层脂质体
[0017] ①将超声探头浸入空白脂质体中，50°C以上进行频繁间歇超声，所述频繁间歇超 声是每次超声功率80%，每次超声30s，间歇30s，超声4-8次；
[0018] ②超声后，空白脂质体以1700g转速离心2min，除去金属钛碎末，并在50°C以上放 置Ih~2h得单层脂质体；
[0019] (4)脂质体包封流感疫苗蛋白
[0020] ①将单层脂质体中与1500 μ g~2500 μ g流感抗原液混合；
[0021] ②反复冻融：-40°C低温冰箱快速冷冻lh，25°C缓慢融化，反复冻融2-4次；
[0022] (5)流感疫苗脂质体冻干粉的制备
[0023] ①反复冻融后，以_40°C低温预冻4h~8h ;
[0024] ②于冷冻干燥机上-52°C、0. 06mbar冻干28h以上，得到白色疏松状冻干粉体即为 流感疫苗脂质体，置4°C贮存。
[0025] 进一步，在步骤（1)所述于37°C减压旋转蒸发时，充入氮气60s，除去无水乙醇溶 剂；在步骤（3)①将超声探头浸入空白脂质体中，充入氮气，再50°C以上进行频繁间歇超 声。
[0026] 进一步，步骤（2)①在磷脂膜中加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液为30ml ;步骤 (3)①中超声6次；步骤（4)①将单层脂质体与2500 μ g流感抗原液混合，步骤（4)②反复 冻融4次。
[0027] 本发明的有益效果是：
[0028] 本发明方法采用冻融-干燥法制备流感疫苗脂质体，克服了常用方法制备疫苗脂 质体中温度过高引起蛋白质类疫苗变性，影响其免疫原性的弊端。该方法操作简便、快捷， 各参数的控制，使制得的脂质体粒径均匀，有较低的渗透性，在溶液中稳定，既提高了疫苗 的包封率，又能保障对温度敏感的蛋白类疫苗的有效性。本发明方法建立了一套适用于大 多数疫苗脂质体制备的方法，具有很强的应用性。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1-实施例4分别对影响冻融-冻干法制备流感疫苗脂质体工艺的影响因 素：投药量、水合介质用量、超声次数和冻融次数在技术方案中提到的相关技术参数范围内 进行验证，每个验证指标进行3次重复实验。通过对验证结果统计分析，在其它因素固定不 变的情况下，包封率随投药量的增加而增加，但均在70 % -80 %以内，综合考虑包封率与不 被包封的药物的量，为避免过多药物的损失（不被包封的药物在500 μ g左右），将投药量考 察范围确定为1500 μ g到2500 μ g。
[0030] 水合介质的用量过小，水化后脂质体粒度不规则，碎片多；用量太大，粒度不太均 匀，且数量减少，稳定性偏差。结合包封率确定水合介质的用量最佳范围为25ml到35ml ;超 声4次以上粒径范围变为1-10 μ m，以1-4 μ m为主，超声10次后粒径范围变为0. 5-1 μ m。 超声4次以上包封率均大于75%。
[0031] 由于疫苗肺部给药，脂质体粒径越小吸收越快，肺部沉积率越高，但不应小 0. 5 μ m，否则粒子会随呼气排除体外，且粒径过小，脂质体冻融过程中有效包封体积减少， 也影响包封率。故超声次数最佳范围为4-8次；包封率随冻融次数的增加而增加，但是3次 以上之后均为75%以上，且变化不明显。且由于冻融过程中存在脂质体膜的破裂与融合过 程，小粒径脂质体融合成粒径稍大的脂质体，随着冻融次数的增加脂质体粒径会变大，故冻 融最佳次数确定为2-4次。
[0032] 实施实例5在投药量、水合介质（PBS)的用量、超声频率和冻融次数的最佳取值范 围内，各因素设3个水平，以药物包封率为主要评价指标，脂质径分布为辅助，按L 9(34)正 交设计表安排正交试验，确定脂质体的最优处方及工艺为：投药量2500 μ g，冻融4次，加入 PBS体积为30ml，超声6次。最佳组合的包封率为（82. 74± 1. 67) % (η = 3)，平均粒径约 为2μπι，1·0~4·0μπι粒径约占95 %。
[0033] 实施实例6对脂质体体外稳定性考察，脂质体的理化稳定性直接影响其作为药物 载体的载药性能，在不同的体外储存条件下，会发生不同程度的磷脂氧化和脂质体渗漏，从 而影响其包封率，使