用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求于2012年6月13日提交的临时申请序列号 61/689,806(NAN0CERIA FOR THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS)，2012 年6 月 18 日 提交的临时申请序列号 61/690, 100 (NANOCERIA FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS)，2012 年 10 月 12 日提交的临时申请序列号 61/795, 241 (BIOLOGICAL EFFECTS OF NANOCERIA IN A MODEL OF MULTIPLE SCLEROSIS)以及 2012 年 11 月 16 日提 交的临时申请序列号 61/796, 639 (NANOCERIA FOR THE REDUCTION OF OXIDATIVE STRESS) 的优先权，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明一般性地涉及纳米医学领域的改进。特别地，本发明涉及用生物相容材料 制备的含铈纳米颗粒，制备所述纳米颗粒的方法，以及所述纳米颗粒预防和治疗炎症及氧 化应激相关事件和疾病的用途。
【背景技术】
[0004] 自由基氧化应激在许多人类疾病尤其是神经退行性疾病的发病机理中起着主要 作用。因此，使用可降低特定自由基物类的抗氧化剂进行治疗在理论上可防止组织损伤并 改善存活和神经结果两者。生理环境中的自由基通常可分为活性氧类（reactive oxygen species，R0S)或活性氮类（reactive nitrogen species，RNS)。自由基是具有高度活性的 化学物类并且易于在亚细胞水平上与蛋白质、脂类和核酸反应，从而导致各种疾病的发展。
[0005] 在纳米医学中使用纳米二氧化铺的起源可追溯到Bailey和Rzigalinski的开 创性工作，其中观察到将超细铈氧化物颗粒施用于培养的脑细胞中大大增强了细胞存活 能力，如 Rzigalinski 在 Nanoparticles and Cell Longevity, Technology in Cancer Research&Treatment 4(6)，651_659(2005)中所描述的。更特别地，当使用由反胶束微乳 化技术合成的2至10纳米（nm)大小的铈氧化物纳米颗粒处理体外大鼠脑细胞培养物时， 其表现出长约3至4倍的存活时间，如Rzigalinski等于2003年9月4日提交的美国专利 7, 534, 453中所报道的。铈氧化物纳米颗粒为暴露于由过氧化氢或紫外线暴露所产生的致 死剂量自由基的经培养脑细胞提供了相当大的保护。此外，据报道，铈氧化物纳米颗粒在鼠 体内是相对惰性的，具有较低毒性（例如，尾部静脉注射不产生毒性作用）。虽然没有报道 体内的医学益处，但是假设了用这些二氧化铈纳米颗粒进行治疗的益处，包括减少与创伤、 移植、关节炎、关节病、血管病、组织衰老、中风和创伤性脑损伤相关的炎症。
[0006] 然而，Rzigalinski等随后在WO 2007/002662中报道了这些特定纳米二氧化铈颗 粒的许多问题。通过这种反胶束微乳化技术制备的纳米二氧化铈有几个问题：（1)粒径不 能较好地控制在所报道的2至10纳米（nm)范围内，使得批次之间的可变性较高；（2)用于 最终产物加工的表面活性剂尾料（携带污染物）如双（乙基己基）磺基琥珀酸钠（也称为 多库酯钠或（AOT))导致了毒性反应；（3)当将这些纳米颗粒放置在生物介质中时，表面活 性剂尾料量的无法控制产生了聚集的问题，导致功效和可递送性降低；以及（4)铈（+3/+4) 的价态随时间的不稳定性。因此，通过反胶束微乳化技术制备的铈氧化物纳米颗粒在批次 之间是高度可变的，并且对于哺乳动物细胞显示出比期望毒性更高的毒性。
[0007] 作为替代方案，Rzigalinski等在WO 2007/002662中报道了通过高温技术合成的 纳米二氧化铈的生物功效，其由至少三种商业来源获得。据报道，铈氧化物纳米颗粒的这些 新来源提供了批次之间活性的优异可再现性。还报道了在不考虑来源的情况下，具有小尺 寸、窄尺寸分布和低聚集速率的铈氧化物颗粒是最有利的。就尺寸而言，该公开内容具体地 断定，在颗粒进入细胞内部的实施方案中，进入细胞的颗粒的优选尺寸范围为约Ilnm至约 50nm，例如约20nm。在颗粒从细胞外侧对细胞发挥其作用的实施方案中，这些胞外颗粒的优 选尺寸范围为约Ilnm至约500nm〇
[0008] Rzigalinski等还报道对于递送，纳米颗粒的非聚集形式是有利的。为了实现该目 标，他们报道可在超高纯水中或在用超高纯水所制备的生理盐水中对按重量计约10%的原 液进行超声处理。然而，如其他人注意到的，通过高温技术合成的纳米二氧化铈（例如获得 自商业来源）的超声处理水性分散体是高度不稳定的并且快速沉降（即，在几分钟内），造 成施用来源于这些来源之纳米二氧化铈的水性分散体时具有很大的可变性。
[0009] Rzigalinski等报道了在相对简单的模型系统中的生物功效，包括体外细胞培养 物、经口喂养的黑腹果蝇，以及以明显小于治疗剂量（300纳摩尔或约0. 2mg/kg)尾静脉注 射的小鼠。
[0010] Yokel 等在 Nanotoxicology，2009, 3 (3) :234-248 中描述了对商业二氧化铺纳米 材料的生物分布和氧化应激作用进行的深入研宄。特别地，将得自于Aldrich的5%纳米二 氧化铺分散体（#639648)超声处理3分钟并以50mg/kg、250mg/kg和750mg/kg的纳米二氧 化铈剂量输注到大鼠中。对该材料而言，任何纳米颗粒表面稳定剂的性质都是未知的。纳 米二氧化铈颗粒的尺寸通过各种技术进行表征并且通过动态光散射报道为平均31+/-4nm。 透射电子显微镜法（transmission electron microscopy，TEM)表明大部分颗粒为具有双 峰粒度分布（峰在8nm和24nm处）的片状物，并且一些颗粒为~100nm。观察到使血液与 该形式纳米二氧化铈一起孵育1小时具有范围为~200nm至大于1微米的聚集物，并且当 输注到大鼠中时，其从血液中被快速清除（半衰期为7. 5分钟）。虽然观察到大部分纳米二 氧化铈聚集在肝和脾中，但是尚不清楚任何显著量穿过血脑屏障并进入脑组织细胞。
[0011] 然后，Yokel等试图对纳米二氧化铈表面涂层（稳定剂）进行精确控制并通过 Masui等，J. Mater. Sci. Lett. 21，489-491 (2002)的直接两步水热制备法（其包括柠檬酸钠 作为生物相容稳定剂）制备了纳米二氧化铈的稳定水性分散体。高分辨率TEM表明，该形 式的纳米二氧化铈具有边缘尖锐的结晶多面体颗粒形态以及4nm至6nm的窄粒度分布。据 报道，在7. 35的生理pH和-53mV的G电势下，这些平均尺寸为5nm的二氧化铈纳米颗粒 的柠檬酸盐稳定化分散体在大于2个月中是稳定的。因此在施用前不需要进行超声处理。
[0012] Hardas 等，Toxicological Sciences 116 (2)，562-576 (2010)报道了该形式的朽1 檬酸盐稳定化纳米二氧化铈的广泛生物分布和毒理学研宄的结果。出乎意料地，他们报道 与先前研宄的~30nm纳米二氧化铺（Aldrich(#639648)，以上所述）相比，这种更小的纳米 二氧化铈毒性更大，在脑中未观察到，并且对海马和小脑中的氧化应激产生很小的影响。这 些结果与"设计得更小的纳米材料将易于穿过血脑屏障的假设"相违背。
[0013] 虽然包含铈氧化物的纳米颗粒可通过本领域已知的各种技术来制备，但是所述颗 粒通常需要稳定剂以防止不期望的聚集。关于先前所用的生物相容纳米二氧化铈稳定剂， Masui等，J. Mater. Sci. Lett. 21,489-491(2002)描述了直接产生二氧化铈纳米颗粒的稳 定水性分散体的两步水热方法，其使用柠檬酸盐缓冲剂作为稳定剂。然而，该方法既耗时又 设备密集，其需要在大的密封反应器中进行两个单独的24小时反应步骤。
[0014] Sandford等，WO2008/002323A2报道了使用生物相容稳定剂（乙酸）的水性制备 技术，其直接产生二氧化铈的纳米颗粒分散体而无需进行沉淀或分离步骤，并且不需要后 续的煅烧。三价铈离子被硝酸根离子缓慢氧化为四价铈离子，并且在将乙酸用作稳定剂时 获得了Ilnm微晶尺寸（约等于晶粒尺寸）的稳定的非聚集溶胶。
[0015] DiFrancesco 等在于 2007 年 9 月 4 日提交的 PCT/US2007/077545, METHOD OF PREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES中描述了，在生物相容稳定剂（例如柠檬酸、乳 酸、酒石酸、乙二胺四乙酸（EDTA)及其组合）的存在下，在低pH(< 4. 5)下三价铈离子被 过氧化氢氧化。具体地，稳定剂乳酸和乳酸与EDTA的组合均示出直接产生了纳米二氧化铈 的稳定分散体（平均粒径为3nm至8nm)而无需进行中间颗粒分离步骤。
[0016] Karakoti等在J. Phys. Chem. C111，17232-17240(2007)中报道了通过在酸性条 件（过氧化氢）和碱性条件（氢氧化铵）两者中氧化三价铈离子在单糖/多糖中直接合成 了纳米二氧化铈。所公开的具体生物相容稳定剂包括葡萄糖和葡聚糖。虽然公开了小至 3nm至5nm的单一粒径，但是产生了 IOnm至30nm的弱聚集体。虽然没有描述胶体不稳定性 的起因，但是认为这些颗粒的G电势大小可能不够大。
[0017] Karakoti 等在 JOM (Journal of the Minerals，Metals&Materials Society) 60 (3)，33-37 (2008)中评论了在生物相关介质（使得与生物体生理相容）中合成 纳米二氧化铈的稳定分散体的挑战，诸如需要理解胶体化学电位、粒径、分散剂、溶液 PH等）使得不干扰能够清除自由基（活性氧类（ROS)和活性氮类）的纳米二氧化铈的还原 /氧化（redox)能力。Karakoti等具体描述了在不存在任意稳定剂时以及在存在葡聚糖、 乙二醇和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)稳定剂时，在低pH(< 3. 5)下硝酸铺被过 氧化氢氧化。虽然报道了粒径为3nm至5nm，但是还报道了颗粒聚集至IOnm至20nm。
[0018] Kim等在Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51，1-6中报道了通过反胶束方法合成并用磷 脂-聚乙二醇（PEG)包封的3nm纳米二氧化铈可通过减小脑梗死体积并通过清除ROS来预