>[0252] 步骤13H -化合物Int_13h的合成 将碳酸钾（〇· 195g; I. 41mmol) -次性加入粗制的醛 Int_13g (0· 321g; 0· 705mmol) 和Ohira-Bestmann试剂（0.203g; I. 06mmol)在甲醇（5mL)中的搅拌混合物中，并将得到 的混合物在室温搅拌过夜。加入另一部分的Ohira-Bestmann试剂（0. 102g)，并继续搅拌另 外I. 5h，并将挥发物在减压下除去。使用0-10%的MeOH在二氯甲烷中的溶液作为洗脱液使 用硅胶柱色谱法纯化粗产物。得到炔烃Int-13h (0. 167g; 52. 7%)。[M+H]，450. 44。
[0253] 步骤131 -化合物Int_13i的合成 将DMAP (0.136g; Lllmmol) -次性加入环状氨基甲酸酯Int-13h (0.167g; 0. 371mmol)和二碳酸二叔丁醋（0. 243g; I. llmmol)在二氯甲烧（3mL)中的搅拌混合物中， 并将得到的混合物在室温搅拌过夜。加入DMP (0. 100g)和二碳酸二叔丁酯（0. 100g)的 其它部分，并继续搅拌另外I. 〇h，并将挥发物在减压下除去。使用0-50%的EtOAc在己烷 类中的溶液作为洗脱液使用硅胶柱色谱法纯化粗产物。得到作为白色固体的氨基甲酸酯 Int-13i (0.165g; 68.4%)。
[0254] 步骤13J -化合物Int_13j的合成 将碳酸铯（〇. 〇17g; 〇. 2 mmol) -次性加入环状氨基甲酸醋Int_13i (0. 165g; 0. 254mmol)在甲醇（4mL)中的搅拌溶液中，并将得到的混合物在室温搅拌2h。将挥发物在 减压下除去。使用0-50%的EtOAc在己烷类中的溶液作为洗脱液使用硅胶柱色谱法纯化粗 产物。得到作为白色固体的氨基甲酸酯Int-13j (0. 131g; 83%)。[M+H]，624. 66。
[0255] 步骤13K -化合物Int-13k的合成 在冰浴中冷却的同时，将二氯甲烷（4mL)和三氟乙酸（0.8mL)的混合物加入氨基甲酸 酯Int-13j(0. 131g; 0. 21 mmol)中。将得到的混合物在室温静置lh。将挥发物在减压下 除去。将二氯甲烷加入残余物中，重新浓缩并重复。最后，加入另一部分的二氯甲烷，随后加 入三乙胺。浓缩后，使用0-5%的MeOH在二氯甲烷中的溶液作为洗脱液使用硅胶柱色谱法 纯化残余物。得到作为白色固体的甲硅烷基醚Int-13k (0.074g; 83%)。[M+H] = 424.46。
[0256] 步骤13L -化合物29的合成 将TBAF (0· 19mL IM的在THF中的溶液；0· 19mmol)加入甲硅烷基醚Int-13k (0.074g; 0. 17 mmol)在THF (2mL)中的溶液中。将得到的混合物在室温静置0. 5h，并将 挥发物在减压下除去。使用0-15%的MeOH在二氯甲烷中的溶液作为洗脱液使用硅胶柱色 谱法纯化残余物2次。得到作为白色固体的核苷29 (0.042g; 90%)。
[0257] 1H NMR (599 MHz, CD3OD): δ 8.10 (d; J = 8. 12 Hz; I Η) ；5. 90 (s; I Η)； 5.67 (d; J = 8. 11 Hz; I Η) ；4. 26 (d; J = 8. 22 Hz; I Η) ；3. 93-3. 94 (m; 2 Η) ；3. 75 (dd; J = 12.32; 2.93 Hz; I Η) ;3· 22 (t; J = 8.46 Hz; I Η) ;2· 92 (s; I Η) 〇
[0258] 13C NMR (151 MHz, CD3OD) : δ 166. 2, 152. 7, 143. 9, 142. 5, 136. 1, 120. 9, 108.7, 102.2, 92.7, 84.8, 84.4, 75.9, 75.6, 61.8, 61.8, 60.7, 59.6, 59.6, 59.6，50.9，50.4，50.4，50.3，24.9，20.9，20.8，20.8，14.1。
[0259] 实施例14 5'-三磷酸酯的制备 公开的三磷酸醋的制备在与TriLink biotechnologies, San Diego, CA的合同协议 下进行，或如关于Int-Ha至Int-Hb的转化所述进行。
[0260] 将1-[(21?，31?，45,510-3-氰基-4-羟基-5-(羟基甲基）-3-甲基氧杂环戊 烷-2-基]-1,2,3, 4-四氢嘧啶-2,4-二酮（Int-14a, 15 mg, 0.05 mmol, 1.00 当量） 在磷酸三甲酯（1.0 mL)中的溶液置于氮气氛下。向该溶液中加入质子海绵（17 mg，0.08 mmol, 1.50当量），并将得到的反应物冷却至0°C。向冷却的溶液中加入磷酰氯（32 mg, 0.21 mmol, 4. 50当量），并将得到的反应物在0°C搅拌4小时。然后将焦磷酸酯（或焦 磷酸盐）（200 mg，0.37 mmol, 5.00当量）、N，N-二甲基甲酰胺（LOmL)和三丁基胺 (0.03 mL，10.00当量）加入反应混合物中，并将得到的反应物在0°C搅拌另外1小时。 然后通过加入3.0 mL三乙基碳酸氢铵缓冲液（IM)将反应物淬灭，并将得到的溶液在真 空中浓缩。如下使用制备型HPLC(1#-Pre-HPLC-001(SHIMADZU))纯化得到的残余物：柱， 1#-Pr印C-008(Atlantis HILIC Silica 19*150 186003959 0110182551kk 03)，流动相： 乙腈和水(含有50 mmol碳酸氢铵）；检测器，UV 220和254 nm，得到0. 7 mg作为浅黄色固 体的化合物 Int-14b。1H-NMR (400 MHz，D2O): δ 7.96 (d，1H), 6.45 (s，1H), 6.16 (d, 1H), 4.39 (m, 1H), 4.31 (m, 2H), 4.28 (m, 1H), 1.31 (s, 3H)。
[0261] 31P-NMR (162 MHz, D2O): δ -10.01 (d, IP), -10.62 (d, IP), -22.28 (t, I P) MS (ESI) m/z 506.7 [M] 实例为：
步骤15A -化合物Int-15b的合成 在氮气氛下在_78°C，将nBuLi (0. 285mmol ;1.6M在己烷类中的溶液）逐滴加入乙炔 (0. 028g; 0. 285mmol)在无水THF (ImL)中的搅拌溶液中。当加入结束时，加入酮Int-15a (0. 150g; 0. 285mmol)在无水THF (ImL)中的溶液。搅拌另外Ih以后，将反应物用饱和氯 化铵水溶液淬灭。将有机物萃取进EtOAc中，分离，干燥，并将挥发物在减压下除去。使用 EtOAc在己烷类中（1:1)的溶液作为洗脱液使用硅胶柱色谱法纯化残余物。得到含有另一 种组分的期望加成产物Int-15b (0. 040g)。[M+H]，624. 2。
[0263] 步骤15B -化合物31的合成 将TBAF (0. 071mL LOM的在THF中的溶液）加入甲硅烷基醚Int-15B (0. 022g; 0. 035mmol)在THF (ImL)中的溶液中，并将得到的混合物搅拌lh。将挥发物在减压下除去， 并使用10%的MeOH在二氯甲烷中的溶液作为洗脱液使用硅胶柱色谱法纯化残余物。得到 期望的核苷类似物31 (0. 002g; 18. 3%)。
[0264] 1H NMRS (ppm) (CH30H-d6) : 2. 10 (3H，s)，3. 34 (1H，s)，3. 59-3. 65 (2H，m)， 3.80 (1H, d, J = 5.16 Hz), 3.87 (1H, t, J = 5.27 Hz), 5.11 (1H, t, J = 5.34 Hz), 5.69 (1H, d, J = 5.69 Hz), 6.27 (1H, s), 6.35 (1H, s), 7.15 (1H, d, J = 7.56 Hz), 8.09 (1H, d, J = 7.57 Hz), 10.86 (1H, s)。
[0265] 实施例16 化合物32的制备
步骤16A -化合物Int-Wb的合成 在氮气氛下在-20°〇，将0451'(0.6981^;5.33)逐滴加入乙炔1拉-163(0.4668; 0. 888mmol)在无水甲苯（ImL)中的搅拌溶液中。搅拌另外45min以后，将反应物用饱和碳 酸氢钠水溶液淬灭。将有机物萃取进EtOAc中，分离，干燥，并将挥发物在减压下除去。使 用EtOAc在己烷类中（1:4)的溶液作为洗脱液，使用硅胶柱色谱法纯化残余物。得到期望 加成产物 Int-16b (0.106g; 22.7%)。[M+H], 527.37。
[0266] 步骤16B -化合物32的合成 将TBAF (0. 668mL IM的在THF中的溶液；0. 688mmol)逐滴加入乙炔Int-16a (0. 177g; 0. 344mmol)在THF (2mL)中的搅拌溶液中。在室温搅拌45min以后，将反应物在 减压下浓缩。使用MeOH在二氯甲烷中的溶液（1:10)作为洗脱液，使用硅胶柱色谱法纯化 残余物。得到期望产物 32 (0.060g; 63.2%)。[M+H]，285.19。
[0267] 1H NMR δ (ppm) (CH30H-d4) : I. 86 (3H, d, J = 6. 22 Hz), 3. 33 (1H, t, J = 2.06 Hz), 3.80 (1H, dd, J = 12.67, 2.71 Hz), 3.95 (1H, d, J = 9.66 Hz), 3.99 (1H, dd, J = 12.68, 2.17 Hz), 4.24 (1H, dd, J = 20.26, 9.41 Hz), 5.73 (1H, d, J = 8.12 Hz), 6.20 (1H, d, J = 17.23 Hz), 7.97 (1H, d, J = 8.13 Hz)。
[0268] 实施例17 三磷酸核苷类似物对HCV NS5B聚合酶的抑制 为了测量本发明的三磷酸核苷化合物对HCV NS5B RNA依赖性的RNA聚合酶的酶活性 的抑制，使用放射性地标记的核苷酸掺入测定。该测定是在国际公开号W02002/057287中 描述的测定的改进形式。简而言之，将5〇μL反应物在室温温育1小时，所述反应物含有： 20 mM HEPES (pH 7. 3) ;7· 5 mM DTT ;20 单位 /mL RNasIN ;各 ?μΜ 的 ATP、GTP、UTP 和 CTP ; 2〇MCi/mL [33P]-CTP;10 mM MgCl ;60 mM NaCl ;100mg/mL BSA ;0·02?μΜ DCoH 杂聚物 RNA 模板；和5 nM NS5B (lb-BKA55)酶。然后通过加入500 mM EDTA (5〇μυ终止测定。将反 应混合物转移至Millipore DE81滤板，并使用Packard TopCount确定标记的CTP的掺入。 然后可以从实验计算化合物IC5tl值，所述实验一式两份地使用抑制剂的10个系列3倍稀释 液。使用如在Cheng篆Λ ,Biochem Pharmacol22:3099-3108 (1973)中所述的关于竞争性 抑制剂的Cheng-Prusoff方程式：Ki = IC5(/(l+[S]/4)，其中[S] = ?μΜ，且4是在没有外 源抑制剂的测定中产生半数最大酶活性的同源NTP的浓度，从它的NS5B IC5tl导出NTP抑制 剂的固有效能（Ki)。
[0269] 使用该方法得到本发明的下述选定化合物的NTP类似物的数据，并展示在下面。 该数据指示，所述化合物的三磷酸核苷（NTP)是HCV NS5B聚合酶的有力和有效抑制剂。
[0270] 上表中的化合物是本发明的不同核苷化合物的三磷酸核苷衍生物的三乙胺盐。
[0271] 实施例18 复制子活性和细胞毒性测定 为了测量本发明的化合物的基于细胞的抗-HCV活性，在用本发明的化合物处理之前 1天，将复制子细胞（Ib-Conl)以5000个细胞/孔接种在96-孔板中。然后将不同浓度的 在DMSO中的本发明的试验化合物加给复制子细胞，在测定培养基中含有终浓度为0. 5%的 DMSO和10%的胎牛血清。在给药后3天收获细胞，并用GAPDH RNA作为内源性对照，使用 实时RT-PCR (Taqman测定）确定复制子RNA水平。从实验计算EC5tl值，所述实验一式三 份地使用抑制剂的10个系列2倍稀释液。为了测量抑制剂在复制子细胞中的细胞毒性，在 给药后3天，在与在复制子活性测定中一样处理的细胞上，根据生产商关于CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega,目录号 G3580)的方案进 行MTS测定。CC5tl是与媒介物处理的细胞相比产生50%抑制的抑制剂浓度。使用相同的MTS 方案，可以测量在其它细胞类型中的细胞毒性。
[0272] 使用该方法得到本发明的选定化合物的数据，并展示在下面。该数据指示，所述化 合物具有胜过复制子活性的显著细胞毒性窗。
[0273] 实施例19 线粒体毒性测定 通过与核基因对照相比它对线粒体基因组拷贝数的影响，可以评价抑制剂在复制子细 胞中的线粒体毒性。在抑制剂处理之前1天，将复制子细胞以60, 000个细胞/孔接种在 6_孔板中。在处理前一天，加入不同浓度的在培养基中的抑制剂，并在此后每3天更新给药 培养基。在给药后的指定天，收获细胞；使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen,目录 号69504)分离总DNA，并通过标准分光光度计测量方法定量。可以使用线粒体特异性的DNA 引物的 2 个替代性集合：1) 5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3'（SEQ. ID. NO. I) (F3212,正 向），5'-TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3'（SEQ. ID. NO. 2) (R3319,反向），6-FAM-5'-TTAC CGGGCTCTGCCATCT-3' -TAMRA (SEQ. ID. NO. 3)(探针）（参见 Bai 等>1 , AT Jcat/ Sci 1011:304-309 (2004));或 2) 5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3' （SEQ. ID. NO. 4) (COX II，正向），5'-CGTCTGTTATGTAAAGGATGCGT-3'（SEQ·ID·N0·5)(C0XII，反向），6-FA M-5'-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-3'-TAMRA (SEQ. ID. NO. 6)(探针）（参见 Stuyver 寧 人，Antimicrob Agents ChemotherA^: 3854-3860 (2002))。在 Taqman 定量 PCR 测定中使 用500 nM的引物和200 nM的探针。使用ABI PDAR部件编号4310875 (20X)，平行地进行 18S DNA的核基因对照定量。将得自抑制剂处理的细胞的ACT值（mt DNA和18S DNA之间 的CT差异）与媒介物处理的细胞的ACT值进行对比。使用相同的方案，可以测量在其它 细胞类型中的线粒体毒性。
[0274] 本发明不受限于在意图作为本发明几个方面的举例说明的实施例中所公开的具 体实施方案，并且在功能上等同的任何实施方案均在本发明的范围内。实际上，除本文所示 和所述的那些外，本发明的各种修改将是本领域技术人员显而易见的，并且意图落入到所 附权利要求的范围内。
[0275] 在本文中已经引用了许多参考文献，它们的整个公开内容通过引用并入本文。
【主权项】
1.具有以下结构的化合物：或其药学上可接受的盐， 其中： B是嘧啶碱基； X是 0、S或CH2; R1 是H、R2是H、-C(0) -(C烷基）或者或R1和R2连接形成具有下式的基团：R3是H、F、-OR12、NH2、-CN、N3、-SR12或-CeCR5; R4是H、F、-OR12、NH2、-CN、N3、-SR12、-0-(C6-C1Q芳基）或-C三CR5,使得R3和R4中的至 少一个是-C三CR5; R5是H、C「C6烷基、乙炔基、C 3-(：7环烷基、-C 6-C1Q芳基，其中所述C「C6烷基、所述乙炔 基、所述C3-C7环烷基和所述-C 6-C1(l芳基可以任选地被一个或多个R6基团取代； R6的每次出现独立地选自C烷基、卤素、-0R12、N(R12) 2、-CN、C3-C7环烷基、苯基和苄 基； R7是H、C6-C1(l芳基、5-或6-元单环杂芳基、9-或10-元二环杂芳基，其中所述C6-C1(l 芳基、所述5-或6-元单环杂芳基和所述9-或10-元二环杂芳基可以任选地被卤素、Q-C； 烷基、-o- (crc6烷基）或-(crc3亚烷基）-c(0)o-(crc6烷基）取代； R8是H、crQ烷基、c3-c7环烷基、苯基或苄基； R9是H、CfCe烷基、C3-C7环烷基、苯基或苄基； R1Q是H、C烷基、C2-Cjt基、-(c「c3亚烷基）m-(c3-c7环烷基）或-(c「c3亚烷基） m-(C6-C1Q芳基）； R11是H、C「C6烷基、C3-(：7环烷基、_(C「C3亚烷基）m-C6-C1Q芳基、5-或6-元单环杂芳 基、9-或10-元二环杂芳基； R12的每次出现独立地是H、Ci-C；烷基、C3-C7环烷基或C6-C1(l芳基；且m的每次出现独立地是0或1。2. 权利要求1所述的化合物，其中X是0。3. 权利要求1或2所述的化合物，其中B是尿苷。4. 权利要求1-3中的任一项所述的化合物，其中R3是-C=CR5。5. 权利要求1-3中的任一项所述的化合物，其中R4是-C=CR5。6. 具有下式的权利要求1所述的化合物：或其药学上可接受的盐， 其中： R1 是H、R2是H或-C(0) -(C烷基），或R1和R2连接形成具有下式的基团：R5是H或C3-C7环烷基； 矿是crQ烷基； 烷基；且 ^是^-^烷基。7. 权利要求1-6中的任一项所述的化合物，其中R1是：8. 权利要求7中的任一项所述的化合物，其中R1是：9. 权利要求1-6中的任一项所述的化合物，其中R1和R2连接形成具有下式的基团：且^是^-^烷基。10. 权利要求9所述的化合物，其中R1和R2连接形成具有以下结构的基团：11. 具有以下结构的权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐：12. -种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-11中的任一项所述的化合物或其 药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。13. 根据权利要求12所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自HCV抗病毒 剂、免疫调节剂和抗感染剂的第二治疗剂。14. 根据权利要求13所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包含选自HCV蛋白酶 抑制剂、HCVNS5A抑制剂和HCVNS5B聚合酶抑制剂的第三治疗剂。15. 根据权利要求1-11中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物 中的用途，所述药物用于抑制HCVNS5B活性或用于预防和/或治疗有此需要的患者中的 HCV感染。16. -种治疗被HCV感染的患者的方法，所述方法包括下述步骤：施用有效地预防和/ 或治疗所述患者中的HCV感染的量的（i)根据权利要求1-11中的任一项所述的化合物或 其药学上可接受的盐或（ii)根据权利要求12-14中的任一项所述的组合物。17. 根据权利要求16所述的方法，所述方法另外包括下述步骤：给所述患者施用选自 HCV抗病毒剂、免疫调节剂和抗感染剂的第二治疗剂。18. 根据权利要求17所述的方法，所述方法另外包括下述步骤：给所述患者施用选自 HCV蛋白酶抑制剂、HCVNS5A抑制剂和HCVNS5B聚合酶抑制剂的第三治疗剂。19. 根据权利要求1-11中的任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐用于在有此 需要的患者中抑制HCVNS5B活性或预防和/或治疗HCV感染的用途。
【专利摘要】本发明涉及式(I)的2'-炔基取代的核苷衍生物及其药学上可接受的盐，其中B、X、R1、R2、R3和R4是如本文中定义的。本发明也涉及包含至少一种2'-炔基取代的核苷衍生物的组合物以及使用2'-炔基取代的核苷衍生物治疗或预防患者中的HCV感染的方法。
【IPC分类】C07H19/10, A61K31/7068, C07H19/02
【公开号】CN104918623
【申请号】CN201380070761
【发明人】F.班尼特, Y.黄, L.王, S.L.博金, A.D.克尔克斯, V.M.吉里贾瓦班, G.布托拉, Q.特隆, I.戴维斯, A.E.韦伯
【申请人】默沙东公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年11月14日
【公告号】CA2891125A1, EP2919792A1, US20150299243, WO2014078463A1