一次(每组体系和浓度同第一次加药时)，连续观察，直至最大作用浓度的原头节全部死亡。实验重复三次。
[0028]实验2:三氧化二砷作用后原头节表面结构的变化
[0029]在测活力的同时，随机取相对应的原头节做电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min ;置4%戊二醛固定24h。将原头节放入浓度为50%、70%、80%、90%、100%的酒精内逐级梯度脱水，脱水时间分别为5min、10min、30min、Ih至过夜，临界点干燥，真空喷金L00A，在LE01430VP扫描电子显微镜下观察原头节表层超微结构变化。
[0030]实验3:三氧化二砷作用后原头节内部结构的变化
[0031]在测活力的同时，随机取相对应的原头节做电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min ;置4%戊二醛前固定24h。用小离心管离心，去除上清液，用琼脂糖包埋头节，取出凝胶继续放入4%戊二醛内固定24h。将固定好的原头节用PBS(PH7.4)冲洗3次，每次15min，2% 0s04中后固定lh，用PBS再冲洗两遍。酒精逐级梯度脱水，30%—50%— 60%各 10min，70% 过夜，次日再置 80%— 90% 各 lOmin，100% 30min。之后丙酮逐级脱水，环氧树脂(Epon812)包埋，固定后修型，LKB2088V型超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅双重染色，置于日立H-600型透射电子显微镜观察原头节内部超微结构的变化。
[0032]实验结果:
[0033]参考图1，倒置显微镜下观察，刚从绵羊肝包虫囊肿中抽取的原头节的虫体大多呈内陷型，形态呈椭圆形、近似圆形，体部饱满，虫体各部分清晰完整，虫体内遍布着许多晶莹光亮的钙颗粒，伊红拒染，且有活动性。原头节活性不好或者死亡正常结构被破坏或显示不清，并伊红红染，且无活动性。1640培养基正常体外培养5d后无明显变化。
[0034]倒置显微镜下观察发现，不同浓度的三氧化二砷作用细粒棘球蝴原头节后，开始原头节活动度较1640培养基对照组增强。药物作用3d后，各浓度药物作用组的原头节均出现不同程度的形态变化，由内陷型变为外翻型，吸盘清晰可见，随着药物作用时间的延长，原头节活动度逐渐减弱，并出现虫体边缘不规整，部分头节由于应激会出现“吐泡”现象，顶突处可见大空泡产生，头节体内钙颗粒显著减少。伊红染色可观察到原头节红染比例增加。
[0035]参考图2，为三氧化二砷对体外细粒棘球蝴原头节的杀伤作用。不同浓度三氧化二砷(2ymol/L、4ymol/L、6ymol/L、8ymol/L)体外培养14d的细粒棘球蝴原头节活力测定结果见图2，显示不同浓度三氧化二砷对体外细粒棘球蝴原头节均有抑制作用。其中8 μ mol/L三氧化二砷作用8d原头节死亡率达100%。从活力曲线图中可以看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，原头节的抑制率增加，此作用具有剂量依赖性和时间依赖性。各实验组原头节死亡率与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。
[0036]同时，申请人在扫描电子显微镜下观察了三氧化二砷作用后的原头节超微结构变化，空白对照组原头节形态上多呈内陷型，虫体近似圆形、椭圆形，且表面光整，结构清晰(图4A)。2 μ mol/L三氧化二砷作用细粒棘球蝴原头节5天以后出现顶突外翻，但结构仍然保持完整(图4B)。4ymol/L三氧化二砷作用3天以后虫体表面毛糙，顶突明显外翻(图4C)，当作用5天以后吸盘变形，并虫体损害进一步加重，表面出现塌陷，褶皱(图4D)。6 μ mol/L三氧化二砷作用3天以后头钩紊乱，微毛排列紊乱，虫体固缩并表皮层呈现虫蚀样的改变(图4E)。相同浓度下5天后细粒棘球蝴原头节虫体凹陷且结构遭到严重破坏，已失去正常形态，甚至部分虫体已经开始崩解(图4F)。8 μ mol/L三氧化二砷作用3天以后原头节微毛排列紊乱或消失，体表破坏较其他作用组严重，顶突表面出现严重的破损，吸盘失去原有正常形态，头钩排列紊乱并出现部分缺损(图4G)。5天以后微毛完全脱落，虫体破裂，无原头节正常结构存在(图4H)。
[0037]同时，在透射电镜下观察，正常培养的细粒棘球蝴原头节合胞体带结构较致密，内有大小不等、形状不一的囊泡，排列较规则，外侧有较多排列整齐的微毛；原头节内含有不同类型的细胞，实质细胞的核大而明显，核仁居中，核内染色质较细腻，异染色质较少。三氧化二砷作用后的细粒棘球蝴原头节合胞体带变薄，结构松散，囊泡扩张，纤毛减少，且排列不规则；部分实质细胞基质浓缩，核周隙轻微增宽，核仁消失；合胞体带和腔内出现空泡(图 4)。
[0038]综合上述实验结果可以看到，不同浓度三氧化二砷对体外细粒棘球蝴原头节均有抑制作用，浓度为8 ymol/L的三氧化二砷对细粒棘球蝴原头节杀伤作用最明显，随着时间的延长，抑制作用显著增加(P < 0.05)。在证实三氧化二砷对原头节有抑制作用的基础上，探索不同浓度的三氧化二砷对细粒棘球蝴原头节的形态学影响。研究结果显示，三氧化二砷作用后，可导致体外细粒棘球蝴原头节的形态发生不同程度的改变。内陷型和外翻型原头节是虫体不同的存在形式。当条件适适宜时，原头节顶突内凹，可保护头钩、吸盘、微毛不受损害；当加入三氧化二砷后，外翻型的原头节增多。正常培养的细粒棘球蝴原头节生发层的微毛发育良好，数量多，附着并延伸入角质层内，可增加生发层与角质层的接触面积，有利于营养物质的吸收，在棘球蝴无血液供应的情况下仍可较快生长并不断形成育囊。不同浓度三氧化二砷作用后的细粒棘球蝴原头节，在透射电镜下观察，微毛出现不同程度的缺损，并且生发层内的细胞被空泡和脂滴所替代。其不利于形成育囊，使原头节的生长受到抑制而死亡。总而言之，三氧化二砷对体外细粒棘球蝴原头节有杀伤作用。
[0039]综上所述，本发明所公开的应用，在2 ymol/L及其以上浓度范围内，连续用药5d以上均具有较为明显的杀灭效果；在优选的6-8 μ mol/L范围内，连续用药3d即可具有显著的杀灭效果。
【主权项】
1.三氧化二砷在制备治疗细粒棘球蝴病药物中的应用。2.根据权利要求1的应用，其特征在于三氧化二砷的用药浓度不低于2ymol/L。3.根据权利要求2的应用，其特征在于三氧化二砷的用药浓度为6-8ymol/L。4.三氧化二砷作为细粒棘球蝴原头节抑制剂的应用。5.根据权利要求4的应用，其特征在于三氧化二砷的用药浓度不低于2ymol/L。6.根据权利要求5的应用，其特征在于三氧化二砷的用药浓度为6-8ymol/L。
【专利摘要】本发明公开了三氧化二砷在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，以三氧化二砷杀灭细粒棘球蚴病的病原-细粒棘球蚴绦虫，具有显著的抑制和杀灭效果，可用于对细粒棘球蚴病的治疗。
【IPC分类】A61P33/10, A61K33/36
【公开号】CN105012344
【申请号】CN201510447209
【发明人】姜玉峰, 吕海龙, 贺艳
【申请人】姜玉峰
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月27日