一种多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及金属纳米材料制备领域，具体涉及一种多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(AD)，即老年痴呆症，是一种以记忆和认知功能障碍为主要特征的进行性神经变性疾病。AD多发于老年群体，60岁以上人群中AD的患病率约为5-10%，而在85岁以上人群中的患病率高达40-50%。随着人口的老龄化的加剧以及缺乏有效的预测与治疗的手段，AD患者数量一直在增加，因此AD已经成为继心脏病、癌症、中风之后，导致老年人死亡的第四大病因。大量研究表明，AD患者的大脑一般都表现出以下病理特征:大脑体积的缩小、海马和新皮质的神经元和突触减少、细胞外出现淀粉样蛋白β (Αβ)聚集形成的老年斑以及细胞内磷酸化Tau蛋白形成的神经原纤维缠结。其中，在AD发病机理的研究方面，目前大多数学者都认为，大脑中Αβ的代谢异常引起Αβ聚合沉积形成β淀粉样蛋白斑在AD的发生发展中起关键作用。
[0003]Αβ富含多个疏水性氨基酸、在水溶液中溶解度极低，因而在生理条件下可自发的形成多种形态的聚集体，如由2-6多肽聚集形成的可溶性寡聚体，这是形成淀粉样纤维前的中间形态，其次便是形成折叠片层结构的不可溶纤维，这是Αβ斑块的主要形态。这些可溶性寡聚体和纤丝状Αβ具有很强的神经毒性，可以诱导神经细胞的凋亡，因此有效的防止或减少A β在脑内的聚集，是治疗AD的一个有效策略。
[0004]研究还发现，Αβ聚集形成纤维受多种因素影响，其中金属离子是诱导Αβ形成聚集体的重要因素之一，在AD脑部的淀粉样斑中均检测到高浓度的Zn' Cu2+和Fe'研究表明这一类过渡金属锌、铜、铁等不仅可诱导Αβ形成β折叠还同Αβ的神经毒性密切相关:铜离子可与A β多肽上的组氨酸His结合，使其形成组氨酸桥，这种Cu-A β复合物具有很强的神经毒性，而另一方面，具有氧化还原性的Cu2+与A β结合后催化H 202等活性氧的形成。过量的活性氧渗透过细胞膜会导致DNA损伤、脂质过氧化等氧化损伤；Ζη2+使可溶性Αβ迅速沉淀为抗酶解的淀粉样聚集体。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够抑制Αβ聚集的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米。
[0006]本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以解决:
[0007]一种多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米(简写:Peptide@M0-POM)，是将钒掺杂的多钼氧酸盐Μο-Ρ0Μ8Αβ靶向多肽修饰而成。
[0008]所述的钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM的分子式为(H2O) 3 (NH4) 18[Mo57V6 (NO3) 60183 (H2O)183].56H20;
[0009]优选地，所述A β靶向多肽为Ac-QKLVFF-NH2。
[0010]一种多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米的制备方法，包含如下步骤:将钒掺杂的多钼氧酸盐M0-POM溶液与Ac-QKLVFF-NH2S肽溶液混合，室温下搅拌10?60min，然后在O?10°C陈化6?24h，最后将混合溶液离心、超声、洗涤、干燥即得多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米(简写:Peptide@Mo-P0M)。
[0011 ] 优选地，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液的浓度为100?500 μ M，Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液的浓度为10?50mM。
[0012]更优选地，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液的浓度为100?300 μ Μ，Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液的浓度为10?30mM。
[0013]最优选地，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液的浓度为200 μ M，Ac-QKLVFF-NH2S肽溶液的浓度为20mM。
[0014]优选地，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液和Ac-QKLVFF-NH2S肽溶液的体积比为5 ?10:1。
[0015]最优选地，钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM溶液和Ac-QKLVFF-NH2S肽溶液的体积比为 10:1。
[0016]优选地，多钼氧酸盐Mo-POM溶液为多钼氧酸盐Mo-POM水溶液，与Ac-QKLVFF-NH2多肽溶液为Ac-QKLVFF-NH2多肽水溶液。
[0017]优选地，所述的室温为15?30°C。
[0018]钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM或上述的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
[0019]钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM或上述多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米作为A β聚集抑制剂或Aβ纤维化抑制剂的应用。
[0020]钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM或上述多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米作为药物载体的应用。
[0021]有益效果:(I)本发明发现钒掺杂的多钼氧酸盐Mo-POM具有抑制金属离子诱导的Αβ聚集和纤维化的能力，同时可以有效降低Αβ纤维的神经毒性，可以作为治疗阿尔兹海默症的药物使用；(2)在此基础上，本发明将具有靶向脑部A β能力的多肽Ac-QKLVFF-NH2对Mo-POMs进行修饰，合成了一个新型的多肽功能化的钼多金属氧酸盐纳米PeptideOMo-POM;能够有效抑制Aβ自身的聚集和Zn2+诱导的纤维化，同时，对于已经形成的Αβ纤维还表现出了良好的降解能力；在体外细胞实验研究中发现，PeptideiMo-POM能有效增加PC12细胞的活性，对细胞起到保护作用，并且能有效降低A β纤维对PC12细胞凋亡诱导能力；此外，通过构建BBB体外模型研究发现，PeptideOM0-POM具有良好的透过血脑屏障的能力，可以作为一种潜在的治疗阿尔兹海默症的药物。
【附图说明】
[0022]图1为Mo-POM和P印tideOMo-POM的透射电镜图。
[0023]图2为Αβ40在不同的条件下的聚集程度透射电镜图。
[0024]图3为Αβ 40在不同的条件下的聚集程度ThT荧光曲线图。
[0025]图4为A β 40在不同的条件下的聚集程度ThT浊度图。
[0026]图5为Αβ 40纤维化的抑制和降解程度透射电镜图。
[0027]图6为A β 40纤维对PC12细胞活性影响图。
[0028]图7为P印tide@Mo-P0M对PC12细胞活性影响图。
[0029]图8为PC12细胞中激光共聚焦检测荧光图。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
[0031]以下实施例所述的钒掺杂的多钼氧酸盐Μο-Ρ0Μ(以下简写成Mo-POM)，参照文献Dante Gattesch1.Giant Clusters with Unusual Electronic and Magnetic StructuresDue to Open Shell Metal Centers Embedded Far Apart from Each Other: SpinFrustrat1n and AntisymmetricExchange.1norg.Chem.1996, 35, 1926-1934 中的制备方法制备得到。
[0032]以下实施例中Ac-QKLVFF-NH2S肽(简写为P印t i de)购自吉尔生化(上海，中国)。
[0033]实施例1 P^tideOMo-POM 的制备
[0034]将ImL 200 μ M 的 Mo-POM 水溶液与 100 μ L 20mM 的 Ac-QKLVFF-NH2多肽水溶液混合，室温(25°C )下搅拌30min，然后在4°C陈化8h，最后将混合溶液离心、超声、洗涤、干燥即得 P印tide@Mo-P0M。
[0035]将Mo-POM和P印tide@Mo-P0M溶于水中，再滴加到铜网中进行TEM表征。图1为Mo-POM和P印tide@Mo-P0M的透射电镜图，可以看出Mo-POM和P印tide@Mo_P0M为球形状态，粒径分别为80±5nm和110±6nm，在溶液中粒径分布均一。
[0036]实施例2 PeptideiMo-POM 的制备
[0037]将ImL 500 μ M 的 Mo-POM 水溶液 100 μ L 1mM 的 Ac-QKLVFF-NH2多肽水溶液混合，室温(25°C )下搅拌lOmin，然后在6°C陈化12h，最后将混合溶液离心、超声、洗涤、干燥即得 PeptideOMo-POM。
[0038]实施例3 PeptideiMo-POM 的制备
[0039]将ImL 100 μ M 的 Mo-POM 水溶液与 100 μ L 50mM 的 Ac-QKLVFF-NH2多肽水溶液混合，室温(25°C )下搅拌90min，然后在2°C陈化12h，最后将混合溶液离心、超声、洗涤、干燥即得 P印tide@Mo-P0M。
[0040]实施例4 PeptideiMo-POM抑制A β 40聚集透射电镜实验
[0041]本实施例通过透射电镜观察Αβ 40在不同的条件下的聚集程度以及纤维化。设置实验组为 A β 40+Zn2\ A β 40+Ζη2++Μο-Ρ0Μ 和 A β 40+Ζη2++Ρ印tide@Mo_P0M，其中 A β 40 为20 μ M，Zn2+为40 μ Μ，反应终体积为100 μ L，加入相同浓度的Mo-POM和P印tide@Mo_P0M，在37°C恒温培养箱分别培养24h、48h。孵育完毕，取10 μ L孵育后混合液体滴加到铜网上，随即用0.1%磷钨酸染色，用滤纸吸去多余的染液，最后将样品于透射电镜上观察拍照。结果如图2所示，在Zn2+诱导下孵育48小时之后，Αβ 40聚集程度明显，可以清晰看见纤维状网络结构，说Zn2+为A β 40纤维化的主要诱因之一。在加入单独的Mo-POM纳米后A β 40仍然发生纤维状的聚集，但是与Zn2+诱导聚集程度相比相对减弱，可以看到A β纤维状结构较少并且分散程度高，并且没有发生明显的团聚现象。但是，我们同样观测到大部分的Mo-POM纳米分散在A β纤维周围，说明纳米与纤维之间的亲和性较低，Mo-POM纳米并不能有效的与A β纤维结合从而抑制纤维的形成。但是在P印tide@Mo-P0M存在下，A β 40孵育24h之后形成大部分都是较短的Αβ纤维状结构，并且出现一定程度的团聚现象。在孵育了 48h后，团聚的Αβ短纤维发生崩解，形成较多的球状颗粒和低聚物，其中夹杂少量短纤维。这表明PeptideOM0-POM与Αβ纤维具有很好的亲和作用，并且在结合到纤维上以后，通过稳定蛋白质其天然结构形成无定型的单体或低聚物，因此PeptideOMo-POM可以作为Αβ聚集抑制剂，以此减少Αβ的聚集程度，达到治疗阿尔兹海默症作用。(注:本实施例使用的PeptideOMo-POM 为实施例1 制备得到的 Peptide@Mo-P0M。)
[0042]实施例