。
[0025] DCFH-DA探针法检测H9c2细胞内ROS荧光：
[0026] H9c2细胞悬液接以I X IO5个/mL接种于24孔板中，每孔lmL，分别加入 TPNS (5 μ g/mL)单药；TFE (5 μ g/mL)单药以及 TPNS (5 μ g/mL)联合 TFE (5 μ g/mL)用药组， 每孔设置6个复孔，作用24h后，弃去上清液，加入lmL，10 μ mol/L的DCFA-DA溶液，将其放 入37°C恒温箱中孵育1小时，用不含FBS的DMEM小心地将细胞清洗三遍，在倒置荧光显微 镜下观察。
[0027] JC-I检测线粒体膜电位水平：
[0028] H9c2细胞悬液接以I X IO5个/mL接种于24孔板中，每孔ImL,分别加入 TPNS (5 μ g/mL)单药；TFE (5 μ g/mL)单药以及 TPNS (5 μ g/mL)联合 TFE (5 μ g/mL)用药组， 每孔设置6个复孔，作用24h后，弃去上清液，加入JC-I染色工作液，在37°C恒温相中孵育 20min后终止孵育，弃去工作液，用JC-I染色缓冲液清洗两遍后，弃去缓冲液，第三遍加入 JC-I染色缓冲液，在倒置荧光显微镜下观察。
[0029] 蛋白免疫印迹检测相关蛋白：
[0030] H9c2细胞悬液接以5X IO5个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，分别加入TPNS(5 μ g/ mL)单药；TFE (5 μ g/mL)单药以及 TPNS (5 μ g/mL)联合 TFE (5 μ g/mL)用药组，作用 24h 后， 收集细胞后，裂解细胞后提取总蛋白，根据BCA蛋白定量法检测各蛋白浓度，采用95°C灭活 lOmin，依次进行电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，采用凝胶成像系统进行检测。
[0031] 统计方法：采用GraphPad Prism 5软件分析，蛋白免疫印迹采用Image J软件分 析，数据以i :±S表示，组间采用单因素方（〇neWay AN0VA)分析，P < 0. 05为差异具有统 计学意义。判断药物联合作用的性质采用金正均法计算Q值。
[0032] Q = Ea+b/(Ea+Eb_Ea*Eb)进行计算，
[0033] 其中Ea+b为A、B两药合用时对细胞的效率，Ea为A药对细胞的效率，Eb为B药对 细胞的效率；Q值〈〇. 55为明显拮抗，0. 55~0. 85为拮抗，0. 85~1. 15为单纯相加，1. 15~ 2.0为增强，>2.0为明显增强，。
[0034] 结果分析：
[0035] TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞增殖的协同作用
[0036] 50mmol/L D-半乳糖处理H9c2心肌细胞24小时后，与正常组细胞比较，细胞的活 率显著下降（50.43%，Ρ〈0· 01);单独给予TPNS 5, 25 μ g/mL，细胞活力分别为：53.96 %， 58. 08 %，单独给予TFE 5, 25 μ g/mL，细胞活力为别为：52.98 %，56. 85%，然而当TPNS和 TFE联合用药后，细胞活力明显增加 ，TPNS 5 μ g/mL和TFE 5,25 μ g/mL联合后，活力分别 为：90·43%，89·91%，Q值分别为：l·154，l·127。TPNS25μg/mL和TFE5,25μg/mL联合 后，活力分别为：92.00%，88. 83%。Q 值分别为：1· 145, L 084。其中 TPNS 5 μ g/mL 和 TFE 5 μ g/mL联合效果最好（表1)，因此我们选择TPNS 5 μ g/mL和TFE 5 μ g/mL做后续实验。
[0037] 表1 TPNS或TFE单药或TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞活力影响
[0039] *P〈0. 05, vs D-半乳糖组；&P〈0. 05, vs 相对应的 TPNS 单剂量组；#P〈0. 05, vs 相对 应的TFE单剂量组。
[0040] TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内β -半乳糖苷酶活性的影响
[0041] 当衰老细胞在PH = 6的环境下，细胞中β-半乳糖苷酶活性最高，通过与X-Gal反 应生成深蓝色产物，在光学显微镜下通过观察蓝色的细胞进而说明TPNS联合TFE对衰老细 胞的影响。与正常组比较，D-半乳糖组中大量的H9c2心肌细胞被染成蓝色，5 yg/mL TPNS 单剂量组以及5 μ g/mL TFE单剂量组孵育衰老H9c2心肌细胞，与D-半乳糖组比较，被染 成蓝色的H9c2心肌细胞数量减少；然而同时给予衰老H9c2心肌细胞TPNS 5 μ g/mL和TFE 5 μ g/mL时，与D-半乳糖组、5 μ g/mL TPNS单剂量组以及5 μ g/mL TFE单剂量比较，被染成 蓝色的H9c2心肌细胞数量显著减少。（图1)，
[0042] TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内ROS的影响
[0043] 二氢溴化乙啶可以自由通过细胞膜且在细胞内长期滞留而不外漏的染色剂，当其 被氧自由基氧化时，二氢溴化乙啶转化为溴化乙啶，进入细胞核内通过与DNA紧密结合，产 生绿色荧光，通过观察荧光的强弱从而说明TPNS联合TFE清除活性氧的能力。与正常组比 较，D-半乳糖组中ROS的荧光强度显著增强，当给予衰老H9c2心肌细胞5 μ g/mL TPNS单 剂量以及5 μ g/mL TFE单剂量，与D-半乳糖组比较，ROS的荧光强度均降低，然而同时给予 衰老H9c2心肌细胞5 μ g/mL TPNS和5 μ g/mL TFE时，与D-半乳糖组、5 μ g/mL TPNS单剂 量组以及5 μ g/mL TFE单剂量相比，ROS的荧光强度显著降低。图2即为TPNS联合TFE对 衰老H9c2心肌细胞内ROS的影响。其中，Con :正常组；D-gal :D-半乳糖组；TPNS :5 μ g/mL 三七总皂苷单剂量组；TFE :5 μ g/mL淫羊藿总黄酮单剂量组；TPNS+TFE :5 μ g/mL三七总皂 苷联合5 μ g/mL淫羊藿总黄酮组。
[0044] TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内线粒体膜电位的影响
[0045] 线粒体膜电位使用JC-I探针。线粒体膜电位增高时，JC-I在线粒体中聚集并产生 红色荧光；当线粒体膜电位降低时，JC-I呈现单体状态并产生绿色荧光；通过观察绿色荧 光与红色荧光强弱进而说明TPNS联合TFE对衰老细胞内粒体膜电位的影响。与正常组比 较，D-半乳糖组中绿色荧光强度增强，而红色荧光微弱，分别给予衰老H9c2心肌细胞5 μ g/ mL TPNS单剂量组以及5 μ g/mL TFE单剂量时，与D-半乳糖组比较，红色荧光增强而绿色 荧光减弱。同时使用5 μ g/mL TPNS和5 μ g/mL TFE孵育衰老H9c2心肌细胞，与D-半乳糖 组、5 μ g/mL TPNS单剂量组以及5 μ g/mL TFE单剂量比较，红色荧光显著增强，绿色荧光显 著减弱。结果如图3所示，图3中，白色箭头所指为红色荧光，曲折箭头所指为绿色荧光。
[0046] TPNS联合TFE对衰老H9c2心肌细胞内SIRT1，PGC-1 a，SIRT3蛋白表达量的影响。
[0047] 与正常组比较，D-半乳糖组中，SIRT1，PGC-Ia以及SIRT3蛋白表达量显著降 低（P〈0. 05);与D-半乳糖组比较，5 μ g/mL TPNS单剂量组以及5 μ g/mL TFE单剂量组 中31訂1，？6(：-1€[以及31訂3蛋白表达量增加（?〈0.05);与0-半乳糖组，5以8/1^了?吧 单剂量组以及5 μ g/mL TFE单剂量组相比，5 μ g/mL TPNS联合5 μ g/mL TFE组中SIRT1， PGC-I a，SIRT3蛋白表达量显著增加（P〈0. 05)。结果如图4所示。
【主权项】
1. 一种三七和淫羊藿提取物的混合制剂在制备延缓心脏衰老的药物上的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的三七提取物为三七总皂苷，所述的 淫羊藿的提取物为淫羊藿总黄酮。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，三七总皂苷与淫羊藿总黄酮的重量比为 0? 2_5 :1 〇4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，三七总皂苷与淫羊藿总黄酮的重量比为 1 :1〇
【专利摘要】本发明提供一种三七和淫羊藿提取物的混合制剂在制备延缓心脏衰老的药物上的应用。所述的三七提取物为三七总皂苷，所述的淫羊藿的提取物为淫羊藿总黄酮，且三七总皂苷与淫羊藿总黄酮的重量比为0.2-5：1。进而得出TPNS与TFE可通过调节线粒体结构与功能进而延缓H9c2心肌细胞衰老的作用机制。
【IPC分类】A61P9/04, A61K36/296
【公开号】CN105125613
【申请号】CN201510396825
【发明人】袁丁, 张长城, 王婷, 刘朝奇, 周志勇, 顿耀艳, 赵海霞, 李靳
【申请人】三峡大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月8日