一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA，简称再障)是一种常见的自身免疫性血液系统疾病，是造血干细胞减少导致的外周血全血细胞减少及骨髓增生不良为主要特征的一组疾病，其发病机制涉及造血微环境异常、造血干/祖细胞缺陷和免疫功能紊乱。具体表现为外周血全血细胞减少，骨髓穿刺检查中亦有造血细胞三系减少:中性粒细胞< 0.5父109/1，血小板< 20父109/1，网织红细胞< 1%，非造血细胞增多，患者表达增高的细胞因子包括IFN — γ ,IL-2,TNF- α等。AA病情重，危害大，疗效差，死亡率高，是一种难治性疾病。
[0003]同时，目前研究者还普遍认为再生障碍性贫血是一种获得性骨髓造血功能衰竭症，再生障碍性贫血的发生、发展与T细胞功能亢进引起的造血组织损伤密切相关。
[0004]目前再障的主要治疗手段有:造血干细胞移植(HSCT)和免疫抑制剂(1ST)治疗。其中造血干细胞移植应综合考虑患者年龄、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)与供者间配型符合程度、有无感染及反复输血史等因素，是目前最为可行的方法，但供者来源有限，费用高，病死率高，且5%-15%的患者因为慢性移植物抗宿主病(GvHD)影响疗效和生活质量。免疫抑制治疗适用于急性再生障碍性贫血(SAA)患者。1ST的治疗反应率为60%-80%，5年生存率与HSCT相当，但大多数患者无法痊愈，血细胞数不能恢复到正常状态，5年复发率约为30%。因此HSCT后的并发症和1ST后的复发危险仍旧困扰着当今的临床医生及医学研究者，尚需进一步探索能提高疗效，减轻不良反应的治疗途径。
[0005]间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，不仅具有造血支持作用，同时还具有免疫抑制作用，且具有多向分化、组织修复、异体输注无毒副作用、可移植性和来源广泛的特点。
[0006]间充质干细胞的免疫调节功能如下:间充质干细胞抑制了 T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的功能，也影响了树突状细胞(DC细胞)的活性。此外，间充质干细胞还能够产生多种生长因子、细胞因子、趋化因子以及可能在细胞免疫调节或迀移过程中起关键作用的蛋白酶形成免疫抑制。间充质干细胞在体外有抑制T淋巴细胞增殖的作用，而且这种抑制作用不依赖于间充质干细胞的来源。
[0007]同时研究发现，间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用呈剂量依赖性，随着间充质干细胞剂量的增加，抑制作用增强。因此，间充质干细胞用的免疫抑制疗法需要较大的细胞量才能起到作用，但干细胞移植数量的增加会引起血管栓塞、发热等副作用；所以，如果提高单个细胞的免疫抑制能力，在较少细胞量的情况下，移植较少细胞量即可充分起到免疫抑制作用，提高细胞治疗效力，保证最大的临床移植效果，同时最大限度的减少不良反应，而且降低了治疗成本，具有重要的意义，为自身免疫性疾病患者特别是再障患者带来了福音。
[0008]虽然将间充质干细胞应用于临床再生障碍性贫血治疗，不少病例也取得了一定效果。然而间充质干细胞应用于治疗再障仍处于探索期，还有许多问题有待于进一步的解决，如间充质干细胞的具体输注剂量，间充质干细胞分泌能力、分化潜能对于造血干细胞的具体影响如何等，仍未获得一种针对再生障碍性贫血的干细胞制剂。相信随着对间充质干细胞及干细胞与临床转化研究的不断深入，在不久的未来，间充质干细胞会成为治疗再障的又一种有效的方法。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是针对现有技术中的不足，解决现有技术中针对治疗再障患者的间充质干细胞免疫抑制能力较低，及治疗再障的干细胞制剂及其制备方法的缺陷形成的具体输注剂量，间充质干细胞分泌能力、分化潜能对于造血干细胞的具体影响等，本发明提供了一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的制备方法，弥补现有技术的不足，降低移植抗宿主病发生率，在较短时间内获得更多的具有较强免疫抑制功能的间充质干细胞，满足临床需求，为间充质干细胞的移植功效提供了新的思路，发挥重要的实际应用价值。
[0010]为了解决间充质干细胞免疫抑制能力用于治疗再障，本发明还提供了一种用于治疗再生障碍性贫血的干细胞制备方法，该方法用特殊方法诱导和培养间充质干细胞，可以有效地提高和增强间充质干细胞免疫抑制能力，可进一步制备成治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂。
[0011]本发明是通过以下方式实现的:
一种治疗再生障碍性贫血的干细胞制剂的制备方法，所述的干细胞制剂中的干细胞是通过以下方法制备的，具体步骤如下:
(1)取P3~P6代的间充质干细胞，首先进行流式细胞鉴定，标记物⑶29、⑶44、⑶90、CD105、CD166表达在90%以上；不表达CD34、CD45，在5%以下；
(2)将其以2X104个/ml的浓度混匀于培养基A中，置于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液I次；
(3)当上述细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37°C条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以2X 14个/ml的浓度混匀于培养基B中，置于37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养，培养第2天换液，以后每2天换液I次；
(4)当上述细胞培养融合至80%-90%时，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37°C条件下消化3-4分钟，制备成细胞悬液，以5 X 15个/ml的浓度混匀于培养基C中，置于37°C、5%C0 2、饱和湿度的细胞培养箱中贴壁培养48~72h，培养第2天换液；
(5)将上述步骤(4)特殊培养后的干细胞，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37°C条件下消化3~4分钟，制备成细胞悬液，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液并以生理盐水重悬，以lOOOr/min离心10分钟后弃去上清液，收集沉淀的干细胞备用；
其中:所述的步骤(2)中培养基A的组成是:含10%胎牛血清、I X双抗的DMEM/F12培养基;
所述的步骤(3)中培养基B的组成是:含75yg/L γ干扰素(INF-γ )，75 μ g/L肿瘤坏死因子-a(TNF-a ),15 mg/L碱性成纤维生长因子(bFGF)、15 mg/L表皮生长因子(EGF)、5 g/L牛血清白蛋白(BSA)、1.5 mg/L还原型谷胱甘肽、I X胰岛素-转铁蛋白-砸-乙醇胺添加剂、0.05 mmol/L β -巯基乙醇、10 mg/L氢化可的松、100nmol/L地塞米松和1%非必须氨基酸的无血清DMEM/F12培养基；
所述的步骤(4)中培养基C的组成是:含质量体积比为(1~5)%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素|丐、质量体积比为(1~20) %的复方氨基酸、质量体积比为(0.3-0.7)%的维生素C、20ng/ml的白介素3 (IL_3)、20ng/ml的重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、30ng/ml的白介素11 (IL_ll)、3U/ml的促红细胞生成素(EP0)、50ng/ml的干细胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生长素(HAPO)以及(60-90) ymol/L的氯化钴(CoCl2)的无血清DMEM/F12培养基。
[0012]进一步的，所述的步骤(4)中培养基C的优选组成是含质量体积比为5%的人血白蛋白、质量体积比为0.5%的低分子肝素钙、质量体积比为10%的复方氨基酸，质量体积比为0.5%的维生素C、20ng/ml的