察照射组、药物组、联合组（照射+药物）对肝癌细胞形态的 影响：用PBS洗涤细胞1次；用4%多聚甲醛固定细胞30分钟；用PBS洗涤1次；加入含 0. 1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟，破膜；用PBS洗涤1次；用甲醇配制的0. 3% 过氧化氢溶液（〇. 3% H202in Methanol)中室温孵育20分钟，以灭活切片内源的过氧化物 酶。随后用PBS洗涤3次；在样品上加50 μ 1生物素标记液，37°C孵育60分钟；用PBS洗涤 1次，滴加0. 2ml标记反应终止液，室温孵育10分钟；用PBS洗涤3次；在样品上加50 μ 1 Str印tavidin-HRP工作液，室温孵育30分钟；用PBS洗涤3次；滴加0. 4ml DAB显色液，室 温孵育15分钟；用PBS洗涤3次；用苏木素染色液进行细胞核染色。随后用PBS洗涤3次； 直接显微镜进行观察。其结果如图3所示。
[0074] tunel染色后，正常癌细胞不发生着色；发生凋亡的癌细胞被着棕色，颜色变深， 凋亡的肝癌细胞变小、核固缩。从图3中可以看出：纯药物组、纯放射组、联合组均有促进肝 癌细胞凋亡的作用，其中联合组中肝癌细胞凋亡现象最为明显，肝癌细胞中细胞核染成了 深棕色。这一结果也表明罗汉果皂苷II具有放射增敏作用。
[0075] 4、克隆形成实验
[0076] 克隆形成实验测定细胞放射敏感性。稀释Η印-G2细胞至1 X 104/mL，加入96孔 板，每孔l〇〇yL。分为纯照射组、联合组（药物+照射组）。照射前，药物+照射组中给要 处理加入罗汉果皂苷II (其在联合组中的浓度为ΙΟμ mol/L)作用24h。然后，在室温下，采 用6MV-X线单次照射，剂量分别为OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，照射条件：6MV-X线，室温照射，照 射野面积15cmX 15cm，加1. 5cm等效组织填充物。照射完毕后，更换培养液继续孵育2周 后弃去各孔上清液，甲醛固定，Giemsa染色，倒置显微镜下计含50个以上细胞以上的克隆 数，统计结果，计算细胞存活率。存活分数SF2=(实验组平均0D值/空白对照组平均0D 值）X 100%，放射增敏比SER =放射对照组SFA药物组+放射组SF)。利用多靶单击模 型$=1-(1-6_^计算放射敏感性相关的参数0。、恥、11(。实验重复 3次，取平均值，用 prism 5软件进行曲线拟合以及计算相关放射生物学参数。
[0077] 表1不同剂量射线照射后肝癌细胞存活分数
[0079] 表2罗汉果皂苷II对于Η印-G2放射敏感性的影响
[0081] 实验数据表明用药组的DpSFpDq以及N均明显低于单纯照射组。D。作为多靶学 说重要参数，表示D。指一次放射杀灭63%细胞所需剂量，D。变小意味药物增加了细胞对射 线的敏感性，加入药物后D。从2. 32降至1. 68,罗汉果皂苷II增加了肝癌细胞对射线的敏感 性；SFM直接反映罗汉果皂苷II对细胞敏感的影响，加入药物后SF2降低为39. 23%，实验 结果说明罗汉果皂苷II对肝癌细胞具有增敏作用。Dq (准阈剂量）反映细胞亚致死性损伤 的修复能力，Dq变小说明肝癌细胞亚致死性损伤修复能力降低。实验的结果显示罗汉果皂 苷II对Hep-G2肝癌细胞在辐射增敏实验中具有增敏效应。
[0082] 实施例2
[0083] 本实验例验证了 CAS number为88901-36-4,分子式为C6QH1Q2029的罗汉果皂苷V 对肺癌细胞的放射增敏效果。
[0084] 1、罗汉果皂苷V对肺癌细胞中P53、Bcl_2的影响
[0085] 利用蛋白免疫实验Western Blot检测罗汉果皂苷V对P53、Bcl-2的影响。
[0086] 将 Hep_G2 细胞在不同浓度药（0 μ mol · L \ 10 μ mol · L \ 30 μ mol · L \ 60 μ mol *L 3物培养24h后终止细胞培养，后吸除培养液，采用PBS (浓度为0· Olmol L-l， pH 7. 4)洗涤，加入含PMSF裂解液50 μ L/孔，置冰浴环境中裂解30min。后在14000r min 1的转速下离心l〇min，获得总蛋白。采用BCA比色法测蛋白浓度，取50yg总蛋白，经12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶（含0. 1% Tween 20)封 闭lh，加抗体P53、Bcl-2以及β-actin，一抗4°C孵育过夜（β-actin作为上样量对照）； TBS-T洗膜3次，每次5min ;加辣根过氧化物酶（HRP)标记的二抗，室温孵育lh，用漂洗液 (TBS-T)洗膜3次，每次10min，加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显影，扫描、分析， 检测检测P53、Bcl-2, β-actin蛋白表达水平，其结果如图4所示。
[0087] 如图4所示，经过罗汉果皂苷V处理的A549细胞的Bcl-2蛋白的表达明显下降， 且Bcl-2蛋白的表达量与罗汉果皂苷V的浓度呈现负相关，而P53蛋白表达明显上调，且表 达量与罗汉果皂苷V的浓度呈现正相关。
[0088] 实施例中，罗汉果皂苷V具有上调肿瘤细胞P53和下调Bcl-2的作用，因此，罗汉 果皂苷具有增加肿瘤细胞的放疗敏感性的潜力，可将其用作制备肿瘤放射增敏剂。2、空白 组、纯药物组、纯放射组、联合组（照射+药物）对肺癌细胞凋亡的影响
[0089] 利用流式细胞技术检测罗汉果皂苷V对肺癌细胞凋亡的影响。收集不同分组培养 的细胞，用冷200 yL PBS洗涤细胞两次，收集细胞；加入50 yL的结合液（Binding Buffer) 重悬细胞，加入2yL的Annexin V-FITC混匀，加入5yL PI混匀，避光、室温作用10min，进 行流式细胞仪检测。其检测结果如图5所示。
[0090] 从图5中可以看出，药物组、放射组均有明显抑制肿瘤细胞生长的作用；联合组的 作用效果最好，肝癌细胞凋亡数目明显增加，说明罗汉果皂苷V具有增敏的效果。
[0091] 3、空白组、纯药物组、纯放射组、联合组（照射+药物）对肺细胞形态的影响
[0092] A549细胞分组培养后，吸出废液，每孔加入0. 5mL固定液，固定25min，PBS洗2次， 每次洗3min，加入Hoechst 33258染液，室温避光染色20min。使用荧光显微镜观察细胞形 态变化。其检测结果如图6所示。
[0093] 从图6中可以看出，空白组细胞核完整，着色均勾，荧光成弥散状，未出现细胞凋 亡现象；药物组、放射组中，均出现部分呈颗粒状荧光状凋亡细胞，放射组的效果好于药物 组；联合组中出现大量皱缩、凋亡的细胞，说明联合组对肺癌细胞具有强烈抑制作用。
[0094] 4、克隆形成实验
[0095] 克隆形成实验测定细胞放射敏感性。稀释A549细胞至1 X 104/mL，加入96孔板， 每孔100yL。分为纯照射组、联合组（药物+照射组）。照射前，药物+照射组中给要处 理加入罗汉果皂苷V (其在联合组中的浓度为lOymol/L)作用24h。然后，在室温下，采 用6MV-X线单次照射，剂量分别为OGy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy，照射条件：6MV-X线，室温照射，照 射野面积15cmX 15cm，加1. 5cm等效组织填充物。照射完毕后，更换培养液继续孵育2周 后弃去各孔上清液，甲醛固定，Giemsa染色，倒置显微镜下计含50个以上细胞以上的克隆 数，统计结果，计算细胞存活率。存活分数SF2=(实验组平均0D值/空白对照组平均0D 值）X 100%，放射增敏比SER =放射对照组SFA药物组+放射组SF)。利用多靶单击模 型$=1-(1-6_^计算放射敏感性相关的参数0。、恥、11(。实验重复 3次，取平均值，用 prism 5软件进行曲线拟合以及计算相关放射生物学参数。
[0096] 表3不同剂量射线照射后肺癌细胞存活分数
[0098] 表4