月见草素b-酪蛋白磷酸肽-壳聚糖纳米粒及制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种抗氧化水溶性大环二聚体较质纳米缓释技术开发，特别设及一种 月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒及制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着科学技术不断进步和人民生活水平不断提高，人类对食品的要求已从色、香、 味，向营养、保健方向转变。在功能性食品的研究和开发热潮中，抗氧化类产品因具有独特 的有效抑制自由基的氧化反应而备受关注。人体内一定量的自由基对于传递能量、杀灭细 菌和寄生虫、或参与排除毒素具有重要作用。但在环境污染、工作压力日趋加重的今天，体 内自由基会受到各种诱导而超过了生命所能正常保持平衡的标准。虽然人体能通过自身调 节耐受轻度的氧化应激，但严重应激情况则需要补充抗氧化剂来补救。因此在食品营养学 领域，抗氧化研究热点在于高含量、高活力抗氧化活性成分的发掘，W及如何提高现有抗氧 化能力明确的活性物质在体内的生物利用度。
[0003] 0邸是大环二聚体单宁中的一种，因其发现于月见草，国内又称为月见草素B、月 见草较质。大量研究表明0邸具有较强的抗氧化、抗肿瘤活性与免疫调节作用，W及作为抑 制剂抑制糖巧酶活性从而起到降血糖的作用。按树是重要的木制品原材料，采伐期留下大 量的树叶几乎未加利用就被废弃，按叶醇提物中大量0EB的发现为该物质的进一步开发提 供了可能性。到目前为止，日本已有利用按叶提取物用于食品抗氧化剂的相关研究，我国也 有利用按叶作为饲料及饲料添加剂的报道。运些都为按叶0邸用于抗氧化功能食品提供了 支持。但0邸的分子量大、稳定性差、易被消化酶降解等缺点决定了其作为口服功能保健产 品具有多重吸收屏障。因此，如何利用新技术克服运些吸收屏障是提高0EB口服生物利用 度的关键所在。
[0004] 聚电解质纳米技术是指W两种带相反电荷的电解质为原料，在静电力作用下自组 装构建具有载体功能的纳米尺寸复合物（polyelectrolytecomplexes,PECs)。该技术的 出现成为解决大分子活性物低口服生物利用度的问题一种有效途径。由于纳米小球的微 小体积和特殊结构（10~lOOOnm)，在胃肠道能成批地被转运，因此除具备传统活性物输 送体系所具有的诸如提高活性物的溶解度、增加药物稳定性W及缓释等优点。材料的选择 是该技术重点内容之一，W往报道的一些聚电解质纳米粒的构建设及使用具有潜在毒性溶 剂、不可降解材料、有争议的可生物降解聚合物，增加了口服利用的难度。而理想的最终纳 米产品应该是具有生物相容性、生物可吸收性、生物降解性、无色、无味，并且是Generally recognizedassafe(GRA巧级别。运就需要一些更为安全的食品级大分子来应对运一挑 战。同时，针对包埋的活性物应有更为突出的承载效果和祀向传递效果。壳聚糖，是W氨基 葡萄糖和少量N-乙酷氨基葡萄糖为单元，通过β-1，4糖巧键连接而成的线性高分子，是自 然界中罕见的正电聚电解质。源于壳聚糖的阳离子特性，壳聚糖在生理抑条件下，具有很 强的生物黏附性和对吸收率的提高作用。酪蛋白憐酸肤对人体无副作用，且具有多种功能， 如促进巧吸收等，已被用作食品原料和治疗药物。在工业生产中，酪蛋白憐酸肤是w牛乳 酪蛋白为原料，经膜蛋白酶水解分离纯化而得到的一类富含憐酸丝氨酸的生物活性肤。尽 管酪蛋白憐酸肤的作用机制和构效关系仍未明确，但众多研究表明，在CPPs的氨基酸序列 中，有一段由3个憐酸丝氨酸后跟2个谷氨酸残基组成的高度酸性的极性序列，因序列中的 正电荷的阳离子被馨合，产生了一个阴离子域。因此，带负电荷的CPPs能与带正电基团的 电解质（如壳聚糖）相互作用，有效地结合在一起。总而言之，壳聚糖（C巧和酪蛋白憐酸 肤（CP巧是两种带相反电荷的生物聚合物，具有极好的生物降解性、生物相容性和生物活 性，在构成纳米粒子给药系统的材料中，是两种种理想选择。 阳0化]CPP和CS在水溶液中，通过调整抑，离子强度，浓度，组成等，CPP/CS络合物可W组装成结构稳定的纳米颗粒，该纳米颗粒可被用作受控释放OeB的递送系统。此外，CPP与 CS的性质，如各自的摩尔质量，电荷密度，聚合度和脱乙酷度等，都是影响纳米颗粒制备的 重要因素。其中，pH、CPP/CS质量比及壳聚糖的分子量是Ξ个最重要的因素。然而，上述因 素具体如何影响月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒的生成，W及在制备该纳米粒时 的最适范围，在此之前均未明确。
【发明内容】
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种月见草素B-酪蛋 白憐酸肤-壳聚糖纳米粒的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的月见草素B-酪蛋白憐酸 肤-壳聚糖纳米粒。
[0008] 本发明的再一目的在于提供所述月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒的应 用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳 米粒的制备方法，包括如下步骤：
[0010] (1)配制一定浓度的CPPs溶液、CS溶液和0邸溶液，并调节运Ξ种溶液的抑值和 化C1浓度；
[0011] 似将CPPs和0EB及CSΞ者按一定的添加顺序混合均匀，控制最终溶液中CPP和 0EB占Ξ者的质量分数，且溶液中Ξ者总和终浓度控制在合适范围； 阳01引 做调节体系的抑值，基于自组装原理CPPs和CS包埋0EB的纳米小球生成；
[001引 （4)在体系中加入京尼平（Genipin)对小球进行固定，控制Genipin在体系中的浓 度，得到纳米混悬液；
[0014] (5)对步骤（4)得到的纳米混悬液进行离屯、，去掉上清，对离屯、产物进行清洗、冷 冻干燥，得到月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒。
[0015] 步骤（1)中所述的CPPs溶液、所述的CS溶液和所述的0邸溶液为饱和溶液或非 饱和溶液的状态、pH《3. 00、化C1浓度《Imol/L。
[0016] 所述的CPPs溶液中的化Cl浓度优选为Imol/L。
[0017] 所述的CPPs溶液中的抑值优选为2。
[0018] 所述的CS溶液中的化C1浓度优选为Imol/L。
[0019] 所述的CS溶液中的抑值优选为2。
[0020] 所述的CS溶液优选通过如下步骤制备得到：用0. 5 % (v/v)醋酸溶液溶解CS和 化C1，然后用肥1调节抑值。
[0021] 所述的0邸溶液中的化C1浓度优选为Imol/L。
[0022] 所述的0EB溶液中的抑值优选为2。
[002引步骤似中所述的添加顺序如下：先将CPPs与0EB混合均匀，再逐滴加至处于揽 拌状态的CS溶液中。
[0024]步骤似中所述的最终溶液中CPP和0EB占；者的质量分数优选为：CPP占立者 的质量分数不超过50% ;0EB占Ξ者的质量分数不超过33%。 阳0巧]所述的CPP占Ξ者的质量分数为18~43%。
[0026] 所述的0EB占Ξ者的质量分数为9~25%。
[0027] 步骤似中所述的总和终浓度为不高于5mg/mL;优选为0.125~3. 5mg/mL。
[0028] 步骤（3)中的所述的抑值为不超过6. 00,优选为5. 3~5. 8,更优选为5. 5。
[00巧]步骤（4)中所述的Genipin在体系中的浓度不超过1.Omg/mL;优选为0. 03~ 1.Omg/mL。
[0030] 步骤（4)中所述的Genipin是用乙醇水溶液预溶解后再加入反应体系中。
[0031] 所述的乙醇水溶液的浓度优选为体积百分比60%。
[0032] 步骤巧）中所述的离屯、的条件优选为：在4°C、5000~leOOOg条件下离屯、15~ 30min。
[0033] 一种月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒，通过上述制备方法得到。
[0034] 所述的月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒稳定，具有抗胃酸作用，且包封 率和载药量高，因此，其用途广泛，可用于制药领域、食品领域、保健品领域中进行应用。
[0035] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0036] 1、本发明制备得到的纳米球运载效果显著。制备的纳米粒粒径在300nm内，颗粒 表面带电量巧OmV(易于被小肠黏膜壁吸附），包封率最高可达98 %、载药量最高达33 %。 胆藏稳定性较好，连续胆藏15化后0邸纳米粒的粒径及总量没有明显的差异性变化、粒度 分布均一。且不同批次制备所得的纳米粒表征参数稳定。
[0037] 2、本发明制备得到的纳米球具有明显的缓释和抗胃酸环境的效果，见图4。