[0038] 3、本发明的制备方法选用食源性活性肤CPPs与性多糖CS埋有活性的0EB，两种 原料针对0邸具有突出的承载和祀向传递效果。此外，Ξ种材料均有各自的功能活性，一旦 0EB纳米粒在体内释放，立种活性物质可W共同起作用，活性附加值高，非常适合功能保健 产品的开发。
[0039] 4、天然、无毒的京尼平是一种溶于水的具有双官能团的交联剂，当它与具有氨基 的聚合物反应时，会从白色变成深蓝色。GP交联后的0邸纳米粒在抑1. 2时仍有大量小球 保持较好的颗粒完整性，GP义联可明显提局0EB纳米粒的抑稳定性。
[0040] 5、本发明提供的制备方法采用的工艺流程简单、可操作性强，构建的纳米粒具有 粒径可调、包埋率高、抑响应、绿色、节能、安全等优点，可实现大规模工业化连续性生产，有 利于产品的推广。
【附图说明】
[0041] 图1为本发明按实施例1制备得到的纳米粒的数码倒置显微镜照片图。
[0042]图2为本发明按实施例1制备得到的纳米粒的扫描电镜照片图。
[0043] 图3为本发明按实施例1制备得到的纳米粒在人工模拟胃肠液中的体外释放曲 线。
[0044] 图4为4组体系样品在GP交联前后的粒度变化情况结果图。 W45]图5为4组体系样品在GP交联前后的颗粒表面带电量变化情况结果图。
[0046] 图6为4组体系样品在GP交联前后包封率的变化情况结果图。
[0047] 图7为月见草素B/酪蛋白憐酸肤/壳聚糖复合物混悬液照片图；其中，从左到右 分别为对比例3和对比例4得到的产品。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。 阳049] 实施例1
[0050] 一、月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒的制备方法，具体步骤如下：
[(K)川 （1)材料的选择：纯度90% (w/w)的CPPs为聚阴离子材料、脱乙酷度90%W上且 分子量为130kDa的CS为聚阳离子材料、0邸的纯度90% (w/w)W上，京尼平的纯度为98% (w/w)0
[0052] (2)分别配制一定浓度的CPPs溶液、CS溶液和0邸溶液，并将Ξ种溶液的抑调节 至2. 00、化C1浓度均为Imol/L。此外，用0. 5% (v/v)的醋酸溶液辅助溶解CS，用Imol/L 肥1调节Ξ种溶液的抑。
[0053] (3)将CPPs溶液与0邸溶液混合均匀，再逐滴加至处于揽拌状态的CS溶液中，最 终溶液中〔口口3、〔5及(^6占立者的质量分数分别为43%、43%及14%，溶液中立者总和的 终浓度为1. 40mg/血。
[0054] (4)调节体系的抑至5. 50,基于自组装原理CPPs和CS包埋0邸的纳米小球生成。 [005引 妨在体系中加入京尼平（Genipin)对小球进行固定，得到纳米混悬液，Genipin 在体系中的浓度为0.40mg/mL。其中，京尼平用60% (v/v)的乙醇水溶液预溶解。
[0056] (6)对步骤妨得到的纳米混悬液在相对离屯、力为13400g、离屯、时间30min的条 件下对其进行离屯、，去掉上清，对离屯、产物进行1~2次清洗，冷冻干燥即得WCPPs和CS 为载体包埋0邸的纳米粒粉末。
[0057]二、检测：
[0058] (1)形态观察：将本实施例制备得到的纳米粒通显微镜和电镜进行观察，其中，图 1为数码倒置显微镜照片图，图2为扫描电镜照片图。从图1和图2可知，本方法制备的纳 米粒大小均一，粒径分布在100~300nm之间。
[0059] 似粒度（W下例子同）：样品适量于样品池中动态光散射化巧法测定复合物在 水中的流体力学直径化(Particlesize)、分散数（Pdl)W及光强值，溫度25°C，各样品平 行测定Ξ次。本实施例制备得到的0邸纳米粒的粒径为231. 9 + 4. 8nm。 W60] 做表面带电量（W下例子同）：利用Zeta电位仪通过祀电极测定样品通电后的 电泳迁移率，计算纳米复合物的表面Zeta电位。本实施例制备得到的0邸纳米粒的表面带 电量为 19. 43 + 1. 55mV。
[0061] (4)包封率与载药量（W下例子同）：将制得的纳米混悬液在相对离屯、力为 13400g、离屯、时间30min的条件下对其进行离屯、后，HPLC法测定上清液中0EB的浓度，根据 标准曲线计算样品中的0邸含量，进而根据W下公式得出载药量和包封率。
[0062] 载药量=微粒中所含的0EB量/微粒的总质量X100% ;
[0063] 包封率=微粒中所含的0EB量/投入的总0EB量X100%。 W64] 本实施例制备得到的0邸纳米粒的包封率60. 96%，载药量8. 71 %。
[0065] (4)纳米粒在人工模拟胃肠液中的体外释放率：取冻干后的0邸纳米粒粉末用少 量蒸馈水配制成母液，取1990μL已配制好的人工模拟胃液及肠液（人工模拟胃肠液的配 制参考《中国药典2005版第二部》第72页及158页），加入0ΕΒ母液10μL(0ΕΒ当量浓度 为1.Img/mL)定容至2血于10血试管中，混匀后密封，平放于37°C恒溫震荡水浴锅中水 浴，每隔一段时间（0. 17、0. 5、1、3、6、8、12、18、2地）后分别取出相应试管，在相对离屯、力为 13400g条件下离屯、lOmin，分离上清，W0. 45μm的微孔滤膜过滤。HPLC法分别测定每次离 屯、后上清液中的0邸含量。试验设计Ξ组平行。0邸在各时间点累积释放百分率的计算公 式如下：
[0066]
[0067]V:释药介质及纳米混悬液的总体积（血）； W側 C:释放各时间点离屯、上清液中测得其中OEB的浓度（mg/血）； W例 W:纳米混悬液中OEB的总量（mg)。
[0070] 本实施例制备得到的OEB纳米粒在人工模拟胃肠液中随时间的释药量（％)变化 曲线如图3所示。模拟胃液中，在前化释放率相对较快，达0. 72 %，但累计释药量比较小 (仅1%W内）；模拟肠液中，在1化时达最大释药量（21. 77%)，此后释药量下降。模拟胃 肠液中1她后的释药量均呈下降趋势，推测此后释放出来的游离0邸与介质中的胃蛋白酶 或膜蛋白酶发生了结合所致。该结果表明，本专利发明的纳米粒能有效提高月见草素B在 胃酸中的稳定性，并能在肠液中较稳定地把月见草素B释放出来，起到了很好的缓释效果， 有利于提高人体口服利用度。
[0071] (5)京尼平交联前后月见草素B-酪蛋白憐酸肤-壳聚糖纳米粒在不同抑条件下 稳定性测试：将通过步骤（5)所得交联纳米粒分别在相对离屯、力为13400g、离屯、时间30min 的条件下进行离屯、，去掉上清，对离屯、产物重复清洗1次后，添加与原液等体积蒸馈水重新 溶解得新体系，将该体系的抑逐渐降低至抑5. 5、抑3. 5、抑2. 0、抑1. 2。测定不同抑中纳 米粒的粒度的变化，记录particlesize(P幻、countrate(CR)值。同时对步骤（4)所得未 交联纳米粒体系进行相同的处理，作对照组，试验独立重复3次。 阳〇7引表1交联前后的0EB纳米粒粒度随抑变化的稳定性影响结果[0073]
[0074] 结果如表1所示，可见，随着抑由pH5. 5降低至胃酸环境抑1. 2,交联前体系中 复合物逐渐膨胀变大，最终导致颗粒结构破裂、复合物降解；而交联后复合物的粒径大小随 抑变化不明显，仍为纳米级颗粒，大小在300nmW内、粒度分布均一。样品的光强值CK与 体系中复合物的总量成正相关，由此对比交联前后的CK值变化可W看出，交联后的体系复 合物总量受抑影响变化不明显；而GP交联前体系的CK值随着抑的降低明显下降，当降至 P肥.0W下时CK值降至lOOkcpsW下，说明此时尚存的颗粒总量很少，体系透明度也由浑浊 变得澄清。因此，通过改变体系抑后测定样品在不同抑值时的粒度及其分布与总量变化， 可作为评价GP交联前后体系稳定性是否得到改善的有效方法，且初步可见，添加GP可有效 提高0邸纳米的稳定性。
[0075] (6)纳米粒随时间的变化情况测试步骤：将配制好的纳米粒于室溫下避光储存， 每隔一定时间（0. 5、l、4、12、24、48、96、120、144h)采用动态光散射仪测定其粒径，观察粒 径变化，评估粒子的稳定性。
[0076] 表2 0邸纳米粒粒度随时间的变化情况
[0077]
[0078] 结果如表2所示，可见，将按前述工艺制备好的纳米混悬液适宜条件下连续胆藏 9化后0邸纳米粒的粒径及总量没有明显的差异性变化、粒度分布均一。随着胆藏时间的延 长，粒径有所增大但增大的幅度较小，144h内增加约lOOnm，但仍在纳米范围内、溶液澄