健康雌性昆明小鼠12只为空白对照组，将96只的7周龄系统性红斑狼疮（SLE ) MRL/lpr雌性小鼠按体重随机分为8组，每组12只，分别为SLE模型组、本发明实施例1高剂量 组、本发明实施例1中剂量组、本发明实施例1低剂量组、本发明实施例2高剂量组、本发明实 施例2中剂量组、本发明实施例2低剂量组和阳性对照组。
[0033] 所有小鼠适应性饲养一周后，各组大鼠按如下剂量灌胃给予相应的受试物：高、 中、低剂量组分别灌胃本发明实施例1、实施例2制备得到的药物组合物的高、中、低剂量，分 别为6.0g/kg、3.0 g/kg和1.5 g/kg;阳性对照组灌胃1.5 g/kg的醋酸泼尼松片(兰州佛慈 制药股份有限公司，国药准字H62020884)，空白对照组和SLE模型组以等体积的蒸馏水灌 田 冃。
[0034] 所有试验组每天给药1次，连续给药25天，于给药结束时取血备用，摘取脾脏。
[0035] 3.实验方法和结果 3.1本发明药物组合物对SLE小鼠 T淋巴细胞亚群的影响 PBS液的制备：称取8 · 5gNaCl，0 · 2gKCl，2 · 85gNa2HP〇4 · 12H20和0 · 27gKH2P〇4，用IL双蒸 水定容后即得； 红细胞裂解液的制备:称取tris20.594g溶于500-700ml蒸馏水中，再用IMHCl调pH7.65 至1L，配制成tris溶液;再将0.83%NH4C1与tris溶液按9:1比例混合后即得； 脾细胞单细胞悬液的制备:把各组小鼠的脾脏放入盛有冷PBS液的培养皿中清洗，在玻 璃匀浆器中加入3mlPBS研磨，再用200目不锈钢网过滤，把脾匀浆液离心以转速1500rpm/ min离心10分钟，弃上清液，并加入红细胞裂解液2.5ml，混匀，静置5分钟后再加入PBS液2ml 终止裂解反应，再以1500rpm/min离心10分钟，弃去上清液，用I3BS洗三次后加入PBS，在荧光 显微镜下计算细胞数。以上的操作均需在冰上。
[0036]用以上脾细胞单细胞悬液，计细胞数后，把细胞浓度调整为5 X IO6Cells/ml。每一 组取其中一只小鼠脾细胞样本做亚群分析，把已调整浓度的小鼠脾细胞样本加入流式细胞 分析专用管，每只小鼠脾细胞样本制备两管，每管加入样本?〇〇μ1。
[0037]在含有样品专用管的第一管加5μ1抗小鼠荧光标记单克隆抗体⑶3(FITC)和3μ1抗 小鼠荧光标记单克隆抗体⑶4(ΡΕ)，第二管加5μ1⑶3(FITC)和3μ1抗小鼠荧光标记单克隆抗 体⑶8(ΡΕ)。室温闭光孵育30min，各管加入500μ1鞘液，振荡混匀。进行上机分析。实验结果 见表1。
[0038]表1本发明对SLE小鼠 T淋巴细胞亚群的影响
由表1可知，与空白对照组对比，SLE小鼠模型组⑶3+⑶4+淋巴细胞水平显著下降，SLE小 鼠模型组⑶3+CD8+淋巴细胞水平显著上升。与SLE模型组对比，本发明药物组合物和阳性对 照组都能使SLE小鼠⑶ 3+CD4+T淋巴细胞显著上升，使⑶3+⑶8+T淋巴细胞显著下降，其中药物 组合物的高剂量组效果较好。而⑶ 3+CD4+淋巴细胞是辅助性T细胞(Th) ,CD3+CD8+淋巴细胞主 要起抑制性调节作用，故表明，本发明的药物组合物能够纠正SLE小鼠 T细胞亚群的失衡状 ??τ O
[0039] 3.2本发明药物组合物对血清IL-10、抗ds-DNA抗体含量的影响 按试剂盒操作说明操作方法，采用IL-10、抗ds-DNA抗体试剂盒(上海柯丰生物试剂有 限公司），测定各组小鼠血清IL-10、抗ds-DNA抗体的含量，实验结果见表2。
[0040] 表2本发明对SLE小鼠血清IL-10、抗ds-DNA抗体含量的影响
注：与空白对照组比较，*P〈〇.05，**P〈0.01;与SLE模型组比较，#P〈0.05，##P〈0.01;与 阳性对照组比较，λΡ〈〇.〇5。
[0041 ]由表2可知，与空白对照组相比，SLE模型小鼠的IL-10和抗ds-DNA抗体水平明显升 高；与SLE模型组相比，本发明药物组合物的高、中、低剂量组的SLE小鼠血清IL-10和抗ds-DNA抗体水平含量显著降低，其中药物组合物高、中剂量组效果极为显著且优于阳性对照 组。这表明，本发明的药物对于SLE小鼠治疗效果显著。 3.3本发明药物组合物对SLE小鼠尿微量白蛋白含量的影响 标本的采集和检测:于第20天将小鼠分别放于代谢笼中饲养，收集隔夜12小时尿，准确 记录尿量。叠氮钠处理后，离心（2000r/min)IOmin，量取储存的小鼠尿液2ml，各组加溴酚蓝 (0.231mmol/L)显色剂Iml，混匀（防止产生气泡），用紫外分光光度计于600nm下测定吸光度 A。吸光度A反映尿微量白蛋白的含量大小，A值越小，尿微量白蛋白含量越低。
[0042]实验数据按照以下方法进行统计学处理:采用SPSS10.0统计软件，计算数据以均 数土标准差（X士S)表示，多组资料比较采用方差分析，组内比较采用t检验。以ρ〈0·05为有 统计学意义。实验结果见表3。
[0043] 表3本发明药物组合物对SLE小鼠尿微量白蛋白含量的影响（χ±3)
注：与空白对照组比较，*P〈〇.05，**P〈0.01;与SLE模型组比较，#P〈0.05，##P〈0.01;与 阳性对照组比较，λΡ〈〇.〇5。
[0044] 由表3可知，与SLE模型组相比，本发明制备的药物组合物的高、中、低剂量组均能 显著降低SLE小鼠尿液中白蛋白的含量，药物组合物高剂量组效果尤为显著且优于阳性药。 这进一步表明，本发明制备的药物组合物对于SLE小鼠肾脏损伤具有突出的治疗效果。
[0045] 由于已经通过以上较佳实施例描述了本发明，在本发明的精神和/或范围内，任何 针对本发明的替换/或组合来实施本发明，对于本领域的技术人员来说都是显而易见的，且 包含在本发明之中。
【主权项】
1. 一种制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物的方法，其特征在于，所述制备方法包 括以下步骤： (1):称取药物组合物中的各味原料:马齿苋、人参、青黛、黄连、葛根、雪里开、茯苓、忍 冬藤、墨旱莲、莲子心、栀子和甘草;取马齿苋，洗去杂质，干燥后粉碎，过80-100目筛，加入 药材总重量6-10倍量体积分数为60-85%的乙醇，微波提取15-25分钟，微波功率为300-500W，提取温度为45-60°C，过滤并保留马齿苋滤渣，滤液减压浓缩至60°C下测相对密度为 1.10- 1.25的浸膏，制得马齿苋提取物； (2) :取人参、青黛、黄连、葛根、雪里开、茯苓、忍冬藤、墨旱莲、莲子心、栀子和甘草，洗 去杂质，干燥后混匀粉碎成粗粉，与上述马齿苋滤渣合并，加入药材总量6-12倍量的纯化 水，浸泡20-30分钟，回流提取1-3次，每次3-6小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至60°C下 测相对密度为1.10-1.25的浸膏，冷却，边搅拌边缓慢加入乙醇至含醇量为达45-60%，4°C静 置12-24小时，过滤并保留滤渣，得滤液A; (3) :将(2)中得到的滤渣边搅拌边缓慢加入其重量3-6倍量体积分数为45-60%的乙醇， 4°C静置3-6小时，过滤，得滤液B和滤渣;滤渣再用45-60%的乙醇洗涤1-2遍，收集并合并洗 涤液； (4) :合并所述滤液A、滤液B和洗涤液，混匀后减压浓缩至60°C条件下测相对密度为 1.10- 1.25 的浸膏； (5) :将所述马齿苋提取物和(4)中制得的浸膏合并，搅拌均匀，在60°C温度下进行真空 带式干燥，干燥压力为0.02-0.08MPa，进料速度为12L/h，料带传送速度为28cm/min，干燥后 将干浸膏粉碎，过100-200目筛，即得。2. 如权利要求1所述的制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物的方法，其特征在于，以 重量份计，所述药物组合物的药材原料组成为：马齿苋10-25份、人参9-20份、青黛8-15份、 黄连8-15份、葛根6-12份、雪里开6-12份、茯苓3-9份、忍冬藤3-9份、墨旱莲3-9份、莲子心2-6份、栀子3-6份和甘草1-10份。3. 如权利要求2所述的制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物的方法，其特征在于，以 重量份计，所述药物组合物的药材原料组成为:马齿苋10份、人参9份、青黛8份、黄连8份、葛 根6份、雪里开6份、茯苓3份、忍冬藤3份、墨旱莲3份、莲子心2份、栀子3份和甘草1份。4. 如权利要求2所述的制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物的方法，其特征在于，以 重量份计，所述药物组合物的药材原料组成为：马齿苋20份、人参15份、青黛12份、黄连12 份、葛根9份、雪里开9份、茯苓6份、忍冬藤6份、墨旱莲6份、莲子心4份、栀子4份和甘草5份。5. 如权利要求2所述的制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物的方法，其特征在于，以 重量份计，所述药物组合物的药材原料组成为：马齿苋25份、人参20份、青黛15份、黄连15 份、葛根12份、雪里开12份、茯苓9份、忍冬藤9份、墨旱莲9份、莲子心6份、栀子6份和甘草10 份。
【专利摘要】本发明公开了一种制备治疗系统性红斑狼疮的药物组合物的方法，属于中药技术领域。该制备方法为：将马齿苋醇提得马齿苋提取物；取人参、青黛、黄连、葛根、雪里开、茯苓、忍冬藤、墨旱莲、莲子心、栀子、甘草与马齿苋滤渣合并后水提处理后得滤液A，在滤渣中加入乙醇过滤得滤液B，再将滤渣洗涤得洗涤液；合并所述滤液A、滤液B和洗涤液，浓缩得浸膏；将马齿苋提取物和浸膏合并，真空干燥后粉碎，即得。本发明制备的药物组合物具有显著的调节T细胞亚群活性的功效，在治疗系统性红斑狼疮方面具有见效快，疗程短的优点，且对于血管炎具有治疗作用，其疗效显著、安全可靠，具有广阔的临床应用前景。
【IPC分类】A61K36/744, A61P37/02, A61P9/14
【公开号】CN105434601
【申请号】CN201511001613
【发明人】刘学键
【申请人】青岛华之草医药科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月29日