(一)鸡肝细胞最佳培养条件研究
[0036] 1、细胞密度对细胞生长的影响将5种不同密度（1~5万个/ml，5~10万个/ml，10~ 15万个/ml，15~20万个/ml，20~25万个/ml)的鸡肝细胞分别接种同一批次的25cm 2细胞 瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10层细胞工厂中，用同批次的DMEM营养液在同条件下培养， 每个密度接种5瓶/2个，在同条件下培养、观察细胞长成致密单层所需时间及细胞的形态。
[0037] 2、新生牛血清含量对细胞生长的影响用同一厂家生产的新生牛血清，分别按6%、 8%、10%、12%的比例加入DMEM培养液中，培养同一批鸡肝细胞，细胞的终密度均为15~20 万个/ml，每种血清浓度的营养液接种同一批次25cm2细胞瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10 层细胞工厂各5瓶/2个，观察细胞长成致密单层所需时间及细胞形态。
[0038] 3、胰酶对细胞生长的影响所用细胞消化液为0.02 %EDTA-0.25%胰酶溶液，待细 胞消化好后，一部分细胞培养容器倒去消化液加入营养液，另一部分细胞培养容器不弃去 消化液直接加入营养液。营养液为pH值为7.0~7.2、含10 %新生牛血清的DMEM营养液，细胞 密度均为15~20万个/ml。接种同一批次25cm2细胞瓶、225cm 2细胞瓶、3000ml转瓶、10层细胞 工厂各5瓶/2个，在同条件下培养、观察细胞长成致密单层所需时间及细胞形态。
[0039] 4、营养液pH值对细胞生长的影响其它条件均相同，仅营养液的pH值分别调整为 6.8、7.0、7.2、7.4,不同pH值的营养液分别接种25cm2细胞瓶、225cm2细胞瓶、3000ml转瓶、10 层细胞工厂各5瓶/2个，观察营养液颜色变化、细胞长成致密单层所需时间及细胞形态。 [0040](二)I群4型禽腺病毒YBAV-4株最佳培养条件研究
[00411 1、最佳接毒剂量的确定分别在不同培养容器中以0.1%、0.5%、1%、2%、5%五个 不同剂量的YBAV-4株病毒液接种鸡肝细胞，观察并记录出现细胞病变的时间及病变程度， 当80%以上的细胞出现细胞病变（以下简称CPE)收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其 病毒含量(TCID5q)，以TCID 5q最高者的接毒剂量为最佳接毒剂量。
[0042] 2、最佳接毒时间的确定以细胞在三种生长状态下繁殖YBAV-4株病毒液，当鸡肝细 胞长成60~70%单层、长成70~80%单层和长成90%以上单层接种病毒，按1 %的量接毒， 37°C、5%⑶2培养箱培养，当80%以上的细胞出现CPE时收获病毒液，反复冻融2次后，分别 测定其TCID 5Q,以TCID5q最高者的接毒时间为最佳接毒时间。
[0043] 3、最佳培养温度的确定将I群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液按1 %的量接种长成良 好单层的鸡肝细胞，分别置于34°C、36°C、37°C、38°C培养，观察细胞病变出现的时间及病变 程度，当80%细胞出现CPE时收获细胞毒液，反复冻融2次后分别测定其TCID 5Q,以TCID50最 高者的培养温度为最佳培养温度。
[0044] 4、最佳收毒时间的确定将I群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液按1 %的量接种长成良 好单层的鸡肝细胞，分别于37°C、5 %⑶2培养箱培养，当细胞出现70 %、80 %、90 %左右CPE 时收获病毒液，反复冻融2次后，分别测定其TCID5Q,以TCID5Q最高者的收毒时间为最佳收毒 时间。
[0045] 5、最佳维持液血清含量确定将I群4型禽腺病毒YBAV-4株病毒液按1 %的量接种长 成良好单层的鸡肝细胞，维持液中新生牛血清含量分别为1%、2%、3%，分别于37°〇、5% CO2培养箱培养，观察细胞病变出现的时间，当80%细胞出现CPE时收获细胞毒液，反复冻融 2次后分别测定其TCID 5q,以TCID5q最高者的血清含量为最佳维持液血清含量。
[0046] 6、验证试验根据上述的试验结果，我们选择最佳接毒方式、最佳接毒剂量、最佳接 毒时间、最佳培养温度、最佳收毒时间制备了3批病毒液，将病毒液反复冻融2次后，测定病 毒液的病毒含量。
[0047] 实施例3:鸡新城疫、传染性支气管炎、禽腺病毒(I群，4型)抗原的制备
[0048] I.Millipore超滤浓缩机使用，保养条件及使用方法，按厂家提供的使用说明进 行。
[0049] 2.浓缩效果检测
[0050] 2. 1浓缩抗原效检浓缩前留样测定浓缩前病毒液中抗原效价（HA和/EID50/ TCID5q)，浓缩过程中随时取样测定浓缩液抗原效价(HA)，确定浓缩倍数，浓缩后的浓缩液留 样，测定浓缩液中抗原效价(HA和/EID 5Q/TCID50)。
[0051 ] 2.2滤出液抗原检测取浓缩即将结束时(此时浓缩液中抗原浓度最大，滤出液中漏 出抗原的可能性最大）的滤出液，分别采用测定血凝价(HA)、接种SPF鸡胚(观察有无活病毒 漏出）、接种SPF鸡(检测是否有抗原物质漏出）等途径检测漏出液中有无抗原成份。
[0052] 2.3浓缩膜型号选择不同病毒抗原成份的大小不同，不同超滤膜的截留（过滤)孔 径不同，因此选用不同孔径型号（1#、2#、3#、4#、5#)的超滤膜对不同病毒进行截留试验，并 根据滤出液中抗原检测结果、浓缩效检结果及浓缩所需时间，分别确定浓缩三种病毒抗原 所用最佳浓缩膜型号。
[0053] 2.4浓缩效果稳定性试验用最佳型号浓缩膜浓缩NDV、IBV、FADV胚液各3批，检测浓 缩效果的稳定性。
[0054] 2.5浓缩倍数试验用最佳型号浓缩膜，将NDV、IBV、FADV胚液各浓缩至原体积的1 / 2、1/3、1/4、1/5，、测定不同浓缩倍数的EID5Q/TCID5Q，确定适宜浓缩倍数。
[0055] 2.6浓缩成本分析根据浓缩时材料消耗，推算浓缩成本。
[0056](一)毒(菌)种应达到所需标准：
[0057]使用鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎M41株、I群4型禽腺病毒YBAV-4株 作为抗原毒种。
[0058](二)抗原制备以及半成品检验：
[0059] i生产用毒种的制备
[0060] 1.1鸡新城疫病毒La Sota株毒种制备：
[0061]将毒种用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释（如HT4或HT5)，尿囊腔内接种10日龄 SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72~120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液(尿囊 液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:512(微量法）的 鸡胚液混合，定量分装于无菌瓶中，注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。
[0062] 1.2IBV M41株生产用毒种制备
[0063] 1.2.1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释（如HT2)，尿囊腔内接种 10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后30~48小时内死亡的鸡胚及48小时存活鸡胚的胚液， 装于无菌容器内。将检验无菌且病毒含量MO6^EID5qA). lml、对1%鸡红细胞凝集试验为阴 性的胚液混合，定量分装于无菌瓶中，注明收获日期、毒种代次及装量，冷冻保存。
[0064] 1.31群4型禽腺病毒YBAV-4株毒种制备
[0065] 1.3.1毒种繁殖挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1 %毒种的维 持液，置37°C培养36~48小时，当细胞病变达80 %以上时收获，冻融2次，分装于灭菌容器 内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。
[0066] 2制苗材料的选择
[0067] 2.1新城疫病毒、传染性支气管炎制苗材料发育良好的10~11日龄易感鸡胚(NDHI 抗体均<1:4;113!11抗体<31(^2)。
[0068] 2.21群禽腺病毒制苗材料鸡肝细胞。
[0069] 3制苗用抗原液的制备
[0070] 3.1新城疫病毒抗原
[0071] 3.1.1接种取生产用毒种，用灭菌PBS作适当稀释(如HT4或HT5)，按《全自动接种 机使用说明》要求，接种10~11日龄鸡胚，每胚尿囊腔内接种〇.2ml，置36~37°C继续孵育， 不必翻胚。
[0072] 3.1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，孵育至96小时，全部取出，照胚，弃去 死胚，将活胚气室向上直立，置2~8°C冷却12~24小时。
[0073] 3.1.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚液。吸 取胚液置于灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1:256