者应弃去。收获的胚液 灭活前在2~8°C保存，应不超过5日。
[0074] 3.1.4浓缩将收获的胚液在2~8°C条件下，随时抽样测定红细胞凝集价，当红细胞 凝集价不低于1:1024时停止浓缩。留样，进行半成品检验，其余胚液随即进行灭活。
[0075] 3.1.5灭活将病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液 的最终浓度为0.1 %。37°(3灭活16小时（以罐内温度达到37°C开始计时)后取出，置2~8°C保 存，应不超过1个月。
[0076] 3.2传染性支气管炎病毒抗原
[0077] 3.2.1接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水或PBS作适当稀释（如HT2)，按《全自动 接种机使用说明》要求，尿囊腔接种10~11日龄易感鸡胚，每胚〇.2ml，置36~37°C继续孵 育，不必翻胚。
[0078] 3.2.2孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。此后每12小时照胚1次， 死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2~8°C中 冷却12~24小时。
[0079] 3.2.3收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚液。吸 取胚液放于灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应2 1〇6· t3EID5QzO. Iml。同时按现行《中国兽药 典》附录进行无菌检验，应无菌生长。收获的胚液灭活前在2~8°C保存，应不超过5日。
[0080] 3.2.4浓缩将收获的胚液在2~8°C条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，留 样，进行半成品检验，其余胚液随即进行灭活。
[0081 ] 3.2.5灭活将IB病毒液导入灭活罐内，计量加入10 %甲醛溶液，充分混合，甲醛的 最终浓度为0.1 %。36~37°C灭活16小时后取出，留样，进行半成品检验，其余病毒液置2~8 °C保存，应不超过1个月。
[0082] 3.31群禽腺病毒抗原
[0083] 3.3.1细胞制备从液氮罐中取出冻存管置37°C水浴中融化，将细胞移入装有IOml 培养液的离心管中，l〇〇〇r/min离心5分钟。用含20 %新生牛血清的培养液悬浮细胞，置37 °C、5%CO2培养箱培养，当长成良好单层时用胰酶一EDTA消化细胞。
[0084] 3.3.2抗原制备
[0085] 3.3.2.1细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到细胞工厂中，37°C培养。
[0086] 3.3.2.2接毒挑选长势良好的鸡肝细胞，弃掉原培养液，加入含有1 %毒种的维持 液，置37°C继续培养。
[0087] 3.3.2.3观察与收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80 % 以上时收获，冻融2次，取样进行半成品检验。一 15°C保存，应不超过30日。
[0088] 3.3.2.4浓缩将收获的毒液在2~8°C条件下，用超滤浓缩机浓缩2~3倍，留样，进 行半成品检验，其余胚液随即进行灭活。
[0089] 3.3.2.5灭活将病毒液导入灭活罐内，计量加入10 %甲醛溶液，充分混合，甲醛溶 液的最终浓度为〇.2%。37°(3灭活16小时（以罐内温度达到37°C开始计时)后取出，置2~8°C 保存，应不超过1个月。
[0090] 4半成品检验
[0091] 4.1新城疫部分
[0092] 4.1.1红细胞凝集价测定取灭活前的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行测定， 其红细胞凝集价应不低于1:1024。
[0093] 4.1.2病毒含量测定将灭活前取出的病毒液作10倍系列稀释，取1〇4、1〇1、1〇-93 个稀释度，各尿囊腔内接种10~11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1 ml，置36~37°C继续孵育，每日 照胚2次，观察5日。逐胚测定红细胞凝集价，不低于1:128者，判为感染，计算EID 5Q。每0.1ml 病毒含量应2 1〇9'qEID5〇。
[0094] 4.1.3无菌检验取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生 长。
[0095] 4.1.4灭活检验取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔内接种灭活病毒液，每胚0.2ml，置36 ~37°C继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1枚。对所有胚液分别测 定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，判为灭活完全。 [0096] 4.2传染性支气管炎部分
[0097] 4.2.1病毒含量将浓缩后灭活前的胚液进行10倍系列稀释，取10'10'1(^3个稀 释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1 ml，每日照胚2次，观察6日，无论死胚、 活胚(接种后24小时内死亡者除外）均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、蜷缩、发育小 (接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特异性病痕者，判为感染，计算EID 50。 每0.1ml病毒含量2 106'7EID5()，方可用于制苗。
[0098] 4.2.2无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生 长。
[0099] 4.2.3灭活检验取10日龄SPF鸡胚6枚，尿囊腔内接种灭活病毒液，每胚0.2ml，置36 ~37°C继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚。对所有鸡胚进行 检验，应均不出现失水、蜷缩、发育小等现象。将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、 发育小等现象时，认为灭活完全。
[0100] 4.31群禽腺病毒部分
[0101] 4.3. 1病毒含量测定取灭活前的病毒液进行测定，每0.1 ml病毒含量应2 IO7-3TCID5Oo
[0102] 4.3.2无菌检验取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生 长。
[0103] 4.3.3灭活检验将灭活后的病毒液作10倍稀释，接种长势良好的鸡肝细胞(24孔细 胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.Oml;同时设未接种的鸡肝细胞作空白对照，37°C、 5 % CO2培养箱培养，观察120小时。细胞对照孔及样品孔均应不出现细胞病变。将培养物收 获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时，样品孔仍不出现细胞病变时，判定为灭活完全。
[0104] 实施例4:疫苗的制备
[0105] 1油相制备取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C 后，再加司本一 805份，至温度达到115°C时维持40分钟，冷却后备用。
[0106] 2水相制备将灭活的新城疫病毒液、传染性支气管炎、I群禽腺病毒毒液以1:1:2比 例混合。取混合抗原液95份，灭菌的吐温一 805份，充分混匀，使吐温一 80完全溶解。
[0107] 3乳化取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份 后，再以3500r/min搅拌30~40分钟。乳化后，取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心 15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
[0108] 4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2~8°C保存。
[0109](四）疫苗的安全试验
[0110] 1.对靶动物各种接种途径的一次单剂量接种的安全试验
[0111] 取1日龄SPF鸡分为3组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批灭活苗，0.3ml/只； 第2组肌肉注射1401批灭活苗，0.3ml/只；第3组肌肉注射生理盐水0.3ml/只作对照。取22日 龄SPF鸡分为3组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批灭活苗，0.5ml/只；第2组肌肉注射 1401批灭活苗，0.5ml/只；第3组肌肉注射生理盐水0.5ml/只作对照，分别在隔离器内饲养， 连续观察14日。结果颈部皮下注射和肌肉注射两种途径对注射部位及全身没有引起明显不 良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免后15日解剖，注射部位吸收良好，证明 该疫苗经两种注射途径对SPF鸡是安全的。
[0112] 表1不同注射途径对SPF鸡的安全试验
[0114] 注表示鸡只采食、饮水、粪便、精神均正常。
[0115] 2.对靶动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次超剂量接种的安全试验
[0116] 单剂量接种安全试验
[0117] 取1日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只。第1组颈部皮下注射1401批三联苗， 0.3ml/只；第2组颈部皮下注射生理盐水，0.3ml/只，隔离器内饲养，观察14日，记录采食、饮 水、粪便等情况，免后15日解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。取22日龄SPF鸡20只， 分为2组，每组10只。第3组颈部皮下注