射1401批三联苗，0.5ml/只；第4组颈部皮下注射生理 盐水，0.5ml/只，隔离器内饲养，观察14日，记录采食、饮水、粪便等情况，免后15日解剖观察 注射局部病变及疫苗的吸收情况。结果见表2。
[0118] 单剂量重复接种安全性试验
[0119] 取1日龄SPF鸡20只，分为2组，每组10只。第1组颈部皮下注射1401批三联苗， 0.3ml/只，于免疫后14日再次同样剂量再接种1次；第2组颈部皮下注射生理盐水，0.3ml/ 只，于注射后14日再次同样剂量再注射1次，隔离器内饲养，二免后再观察14日，记录采食、 饮水、粪便等情况，二免后15日解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。取22日龄SPF鸡 20只，分为2组，每组10只。第3组颈部皮下注射1402批三联苗，0.5ml/只，于免疫后14日再次 同样剂量再接种1次;第4组颈部皮下注射生理盐水，0.5ml/只，于注射后14日再次同样剂量 再注射1次，隔离器内饲养，二免后再观察14日，记录采食、饮水、粪便等情况，二免后15日解 剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。结果见表3。
[0120] 表2结果表明，疫苗单剂量接种后，观察14日，在注射部位及全身没有引起明显不 良反应，免后15日解剖，注射局部均吸收良好，无肿胀，炎症等，在整个观察期内试验鸡采食 饮水均正常。表3结果表明，疫苗二次接种后，观察14日，在注射部位及全身没有引起明显不 良反应，注射局部均吸收良好，无肿胀，炎症等。在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常。
[0121] 表2SPF鸡单剂量接种的安全试验
[0123]注：1、"_"表示鸡只采食、饮水、粪便、精神均正常;下同。2、免疫途径采用颈部皮下 注射。
[0124]表3SPF鸡单剂量重复接种的安全试验
[0127] -次超剂量接种安全性试验：
[0128] 用1日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批三联苗， 0.6ml/只，第2组颈部皮下注射1402批三联苗，0.6ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联 苗，0.6ml/只，第4组颈部皮下注射生理盐水，0.6ml/只，隔离器内饲养，观察至14日，记录采 食、饮水、免疫前及免后15日SPF鸡体重等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。用7 日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只，第1组颈部皮下注射1401批三联苗，1.0ml/只，第2组胸 部肌肉注射1402批三联苗，1.0 ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，1.0 ml/只，第4组 颈部皮下注射生理盐水，〇.6ml/只，隔离器内饲养，观察至14日，记录采食、饮水、免疫前及 免后15日SPF鸡体重等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。用22日龄SPF鸡40只，分 为4组，每组10只，第1组胸部肌肉注射1401批三联苗，1.0ml/只，第2组颈部皮下注射1402批 三联苗，1.0 ml/只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，1.0 ml/只，第4组颈部皮下注射生理 盐水，0.6ml/只，隔离器内饲养，观察至14日，记录采食、饮水、免疫前及免后15日SPF鸡体重 等，解剖观察注射局部病变及疫苗的吸收情况。用270日龄SPF鸡40只，分为4组，每组10只， 第1组颈部皮下注射1401批三联苗，I .Oml/只，第2组胸部肌肉注射1402批三联苗，I .Oml/ 只，第3组颈部皮下注射1403批三联苗，1.0 ml/只，第4组颈部皮下注射生理盐水，1.0 ml/只， 隔离器内饲养，观察60日，记录临床症状、饮水、采食及产蛋率情况。
[0129]表4 1日龄SPF鸡一次超剂量接种的安全试验
[0134] 表6 22日龄SPF鸡一次超剂量接种的安全试验
[0135]
[0138] 注:每组试验动物数为10只，注射剂量为I .Oml/只。
[0139] 表4~7结果表明，疫苗一次超剂量接种后，观察14日，在注射部位及全身没有引起 明显不良反应，疫苗注射组与对照组SPF鸡增重无太大变化，解剖观察，注射局部疫苗吸收 良好，无肿胀，炎症等，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常。产蛋鸡试验结果表明，三联 苗在产蛋期内免疫对产蛋期蛋鸡是安全的，产蛋率、体重基本不受影响。
[0140](五)免疫期试验
[0141 ]用实验室试制的3批苗进行1日龄及22日龄SPF鸡的抗体消长规律和免疫持续期的 研究。三联苗免疫1日龄SPF鸡，试验结果显示，NDV部分:免疫后21日、5个月内ND抗体均2 6.01og2,攻毒后10/10保护;免疫后6个月，抗体少数降至41og2以下，攻毒后5/10~6/10保 护；而非免疫对照鸡攻毒后均5/5死亡。H9亚型AIV部分：免疫后21日、5个月内H9抗体2 8.01og2，攻毒后9/10以上病毒分离保护;免疫后6个月，抗体降至7.51og2以下，攻毒后9/10 以上病毒分尚保护；而非免疫对照鸡攻毒后病毒分尚率均为9/10~10/10。禽腺病毒部分： 免疫后7日少数鸡能检测出琼扩抗体，免后21日~6个月琼扩抗体均7/10及以上阳性，免疫 后21日、5、6个月攻毒免疫组均达到8/10及以上保护;对照组攻毒后均8/10及以上发病。从 以上结果来看，三联苗接种1日龄SPF鸡(0.3ml/只）后5个月内仍能够达到理想的保护效果。 三联苗免疫22日龄SPF鸡，试验结果显示，疫苗免疫后7个月个别鸡抗体降至临界值水平。攻 毒后免疫组产蛋率与正常对照组产蛋率差异不大，而攻毒对照组鸡产蛋率明显下降。由此 可见，三联苗ND部分保护期可达7个月。从以上结果来看，三联苗接种22日龄SPF鸡(0.5ml/ 只）后7个月内仍能够达到理想的保护效果。考虑到饲养环境以及实际生产情况，为预防鸡 新城疫、H9亚型禽流感、I群4型禽腺病毒的发生，我们将免疫剂量及免疫期定为:3周龄及以 内鸡，0.3ml/只，免疫期为4个月。3周龄以上鸡，0.5ml/只，免疫期为6个月。 [0142] 表8 1日龄SPF鸡免疫期试验
[0145]而且，本发明的灭活疫苗对于YBAV-4株的攻毒的免疫效果明显好于市售的I群4型 禽腺病毒疫苗，推测是由于YBAV-4株基因发生变异导致的。
【主权项】
1. 一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗，其特征在于，所述的 三联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽腺病毒。2. 如权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸡新城疫病毒为鸡新城疫病 毒La Sota株。3. 如权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的传染性支气管炎病毒为传染 性支气管炎M41株。4. 如权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的禽腺病毒为I群4型禽腺病毒 YBAV-4株，其保藏编号为CCTCC N〇.V201541。5. 如权利要求1所述的三联灭活疫苗，其特征在于，所述的病毒的灭活采用甲醛灭活。6. 权利要求1所述的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下 的步骤： 1) 油相制备： 取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C后，再加5份司本 80,至温度达到115°C时维持40分钟，冷却后完成油相制备； 2) 水相制备： 将灭活的新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、I群禽腺病毒毒液混合;取混合抗原 液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀； 3) 乳化 取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30~40分钟完成乳化制 备。
【专利摘要】本发明的提供一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗，其中禽腺病毒为I群4型禽腺病毒YBAV-4株，其保藏编号为CCTCC？No.V201541。本发明的疫苗所使用的I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID50效价高、免疫原性好并能抵御禽腺病毒病各地方分离毒的攻击。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，三联苗无明显差异，均稳定有效；效力试验结果证明，三联苗和三种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴性。CCTCC No.V20154120151015
【IPC分类】A61K39/235, A61P31/14, A61K39/215, A61K39/17
【公开号】CN105535958
【申请号】CN201610099731
【发明人】李陆梅, 邹敏, 刘新文, 宫晓, 孙健, 王丽萍
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月23日