癌细胞的作用，对乳腺癌细胞株进行表达谱分析。将来自MDA-MB-231和BT-20乳腺癌细 胞株的细胞用1〇福硫蒽酮处理48小时。使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen， Germantown，MD)分离出总RNA并用TURBO DNA-free?试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA)处理。根据生产商的说明，将每个样品300ng的总RNA扩增并与GENECHIP?人基因 1 · 0ST阵列（Affymetrix，Inc ·，Santa Clara，CA)杂交。用764，885个不同的探针进行约28， 869个良好注释的基因的表达的这些阵列测定。使用默认的Partek归一化参数将 Affymetrix CEL文件导入至pARTEiC Genomics Suite?6.4(Partek Inc.，St.Louis，M0)， 并调整稳健多阵列平均(RMA)分析用于探针序列和GC含量(GC-RMA)。使用分位数归一化进 行贯穿所有阵列的数据归一化。鉴定显著上调的基因（P〈〇.05且>4倍增加）。数据表示经硫 蒽酮处理后向上调节至少4倍的基因。
[0195] 在硫蒽酮诱导的基因中，两个细胞株中的组织蛋白酶D(CTSD)、基质金属蛋白酶-I (MMPI)以及细胞色素 P450,家族1，成员Al(CYPIAI)均增加（图3A)。
[0196] 组织蛋白酶D的定量实时PCR分析。溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D是细胞凋亡的关键 介质，并且据报道将其释放至胞质溶胶可促进细胞死亡。鉴于这一点，我们使用定量实时 PCR(qRT-PCR)来进一步评价在硫蒽酮介导的细胞死亡期间组织蛋白酶D的作用。为进行 qRT-PCR，将来自MDA-MB-231或BT-20细胞株的细胞用ΙΟμΜ硫蒽酮处理48小时，然后收获用 于分析。使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen，Germantown，MD)分离出总RNA并用TURBO DNAfree?试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)处理。在20yL反应混合物中，使用 高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)，由 lyg RNA进行第一链 cDNA合成。使用商购的TaqManO基因表达测定(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行 组织蛋白酶D和GAPDH转录物的扩增。对比GATOH的表达将mRNA的水平标准化，并且用2_Aet* 法计算相对基因表达。
[0197] 定量实时PCR(qRT-PCR)确认在两个细胞株中，硫蒽酮诱导组织蛋白酶D水平的显 著增加（图3B)。此外，如通过免疫细胞化学所测量的一样，硫蒽酮还能明显增加组织蛋白酶 D蛋白质水平并且促进其细胞溶质聚集(图3C)。
[0198] 实施例4
[0199] 组织蛋白酶D诱导促进硫蒽酮介导的细胞凋亡
[0200] 组织蛋白酶D在乳腺癌中表达。由于组织蛋白酶D显著促进硫蒽酮介导的细胞凋 亡，在4个乳腺癌细胞株中，通过免疫印记研究组织蛋白酶D的表达，并且通过PI-FACS研究 细胞凋亡。将来自乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT-474、SKBR-3和BT-20的细胞以10，000细胞/ 孔接种于96孔微量培养板，使其贴壁24小时。然后将细胞用10μΜ硫蒽酮处理72小时(对于细 胞凋亡测定为48小时）。对于免疫印记，将细胞处理后收获并如上所述测定组织蛋白酶D的 水平。通过碘化丙啶(ΡΙ)染色和sub-Go/GiDNA含量的荧光激活细胞分选(FACS)分析，将体外 药物暴露后的促细胞凋亡作用定量化。数据是三次独立实验的代表。如所预期的一样，硫蒽 酮处理后组织蛋白酶D的水平大大提高（图4A)并且与细胞凋亡（图4B)有关联。
[0201] 组织蛋白酶D敲除减少硫蒽酮诱导的细胞凋亡。为进一步确立组织蛋白酶D在硫蒽 酮诱导的细胞凋亡中的机制性作用，用siRNA敲除其表达（图MhsiRNA组织蛋白酶 (Cahepsin)D和无革E标SMARTpool siRNA的制剂购自 Dharmacon(Lafayette，C0)。根据生产 商的方案使用01 igof ectamine(Invitrogen，Car 1 sbad，CA)，用100nM无革E标或组织蛋白酶D siRNA转染来自MDA-MB-231乳腺癌细胞株的细胞。在37°C将转染的细胞孵育24小时，然后用 10μΜ硫蒽酮处理48小时。在48小时通过免疫印记使用α-组织蛋白酶D抗体测量RNAi的功效。 细胞凋亡通过PI染色和流式细胞术测定。结果表明组织蛋白酶D水平降低的细胞对硫蒽酮 介导的细胞凋亡的敏感性显著较低（图4D)。
[0202] 实施例5
[0203] P53未减少组织蛋白酶D积聚或硫蒽酮的活性
[0204] p53的功能的缺失是人癌症中的常见事件，它和肿瘤发生和耐药性有关。因此，具 有不依赖于P53状态的功效的剂是非常可取的。为研究p53在硫蒽酮介导的细胞死亡中的作 用，等基因的Ρ53+Γ和p53-rHCT116结肠直肠癌细胞株（图5A)。重要的是，不管p53状态如 何，硫蒽酮诱导的组织蛋白酶D同等地积聚（图5B)。与等强度的组织蛋白酶D的诱导一致，硫 蒽酮将HCT116 ρ53+Γ和ρ53-Γ-细胞株两者中的活力减少至类似的程度（图5C)。因此，p53 的缺失未减少组织蛋白酶D积聚或硫蒽酮的活性。
[0205] 实施例6
[0206] 硫蒽酮增强伏林司他的活性
[0207] 由于硫蒽酮抑制自噬，它也能增强诱导该途径的化学治疗的活性。基于噻吨酮的 自噬抑制剂伏林司他诱导细胞凋亡和自噬两者，而自噬的抑制显著增强其促细胞凋亡活 性。为确定硫蒽酮和伏林司他的联合是否有效，在4个乳腺癌细胞株中，通过免疫印记研究 组织蛋白酶D的表达，通过MTT测定研究细胞活力，并且通过PI-FACS研究细胞凋亡。
[0208] 将来自乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT-474、SKBR-3和BT-20的细胞以10,000细胞/ 孔接种于96孔微量培养板，使其贴壁24小时。对于免疫印记，随后将细胞用ΙΟμΜ硫蒽酮、2.5 μΜ伏林司他或其组合处理72小时，收获，并如上所述测定组织蛋白酶D的水平。对于ΜΤΤ细胞 活力测定，随后将细胞用1〇μΜ硫蒽酮、2.5μΜ伏林司他或其组合处理72小时。处理后，3-(4， 5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四氮唑（ΜΤΤ)在处理后加入，并使用BioTek (Winooski，VT)微孔板读数器将细胞活力定量化。对于细胞凋亡测定，将细胞用ΙΟμΜ硫蒽 酮、2.5μΜ伏林司他或其组合处理48小时。通过碘化丙啶(ΡΙ)染色和sub-Go/GiDNA含量的荧 光激活细胞分选(FACS)分析，将体外药物暴露后的促细胞凋亡作用定量化。数据是三次独 立实验的代表。
[0209] 对比任一单剂治疗（图6A)所得结果，硫蒽酮和伏林司他的组合导致MDA-MB-23I细 胞中组织蛋白酶D的诱导增加，这与细胞活力降低（图6B)和细胞凋亡增加（图6C)有关。这些 数据提供的证据证明用硫蒽酮抑制自噬可成功地增加伏林司他的抗癌活性。
[0210] 实施例7
[0211 ]硫蒽酮增强贝林司他的活性
[0212]为进一步探索和详述硫蒽酮可成功地增加 HDAC抑制剂的抗癌活性的发现，通过 MTT测定评价细胞活力，我们研究硫蒽酮与另一种HDAC抑制剂（贝林司他)组合的功效，并在 4个乳腺癌细胞株中通过PI-FACS研究细胞凋亡。
[0213] 将来自乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT-20的细胞以10,000细胞/孔接种于96孔微 量培养板，使其贴壁24小时。对于MTT细胞活力测定，将细胞用5μΜ硫蒽酮、ΙμΜ贝林司他或其 组合处理72小时。处理后，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5,二苯基溴化四氮唑(ΜΤΤ)在处理 后加入，并使用Bi 〇Tek(Win〇〇Ski，VT)微孔板读数器将细胞活力定量化。对于细胞凋亡测 定，随后将细胞用1〇μΜ硫蒽酮、ΙμΜ贝林司他或其组合处理48小时。通过碘化丙啶(PI)染色 和sub-GoAhDNA含量的荧光激活细胞分选(FACS)分析，将体外药物暴露后的促细胞凋亡作 用定量化。数据是三次独立实验的代表。
[0214] 硫蒽酮和贝林司他的组合导致细胞活力降低（图7A)和细胞凋亡增加（图7B)。这些 数据提供的证据证明用硫蒽酮抑制自噬可成功地增加贝林司他的抗癌活性。
[0215] 总之，应理解，尽管通过提及具体实施方案强调了本说明书的方面，本领域技术人 员将容易理解，这些公开的实施方案仅为阐明本文公开的主题的原理。因此，应理解，公开 的主题决不限于本文描述的特定的方法学、方案和/或试剂等。因此，可在不违背本说明书 精神的情况下，根据本文的教导对本公开的主题进行各种修改或改变或替代性构造。最后， 本文使用的术语仅为描述特定的实施方案，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅 仅由权利要求确定。因此，本发明不限于本文所精确显示和描述的。
[0216] 在本文中描述了某些实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。当然， 对本领域的技术人员来说阅读上述说明后这些所述的实施方案中的改变应该是显而易见 的。发明人期望熟练的技术人员酌情利用这些改变，并且发明人旨在以不同于本文具体描 述的方式实施该发明。因此，此发明包括如适用法律所许可的所附的权利要求所列举的对 象的所有修改和等价物。此外，在其所有可能的改变中上述组分的任何组合涵盖于本发明 中，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。
[0217] 不应将本发明的替代性实施方案、元素或步骤的分组解释为限制。每个组成员可 以单独提及和要求保护或者与本文公开的组成员组合提及和要求保护。为方便性和/或专 利性原因，组的一个或多个成员可预期包括于组中或从组中删除。当发生任何这种包括或 删除时，说明书被视为包含改变的组，因而符合所附权利要求中使用的马库什(Markush)组 的书面描述。
[0218] 除非另外指出，本说明书和权利要求中使用的表达特性、物品、量、参数、性质、术 语等的所有数字应理解为在所有情况下被术语"约"修饰。如本文使用的术语"约"意指特 性、物品、量、参数、性质或术语，其限定为涵盖在所述特性、物品、量、参数、性质或术语的数 值以上或以下加或减百分之十的范围。因此，除非显示相反，说明书和所附的权利要求中所 列的数值参数为可改变的近似值。至少且并不企图限制与权利要求的范围等价的教义的应 用，每个数值参数应至少根据报道的有效数字的数字和通过应用通常的四舍五入技术来解 释。尽管阐明本发明广泛范围的数字范围和数值是近似值，但具体实例中阐述应尽可能予 以精确报道。然而，任何数字范围或数值固有地包含由发现于它们各自的测试测量中的标 准偏差必然导致的某些误差。本文数值的数字范围的列举仅旨在用作分别提及属于范围内 的每个单独数值的速记方法。除非本文另外指出，否则将数字范围的每个单独数值并入说 明书如同其在本文单独列举。
[0219] 描述本发明上下文（尤其是以下权利要求的上下文）中使用的术语"一个"、"一 种"、"所述"及类似对象解释为涵盖单数和复数，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。 可按任何合适的顺序进行本文所述的所有方法，除非本文另外说明或除非上下文中明显矛 盾。任何和所有实例的使用或本文所提供的示例性语言（例如，"诸如"）仅旨在更好地阐明 本发明而并不是对本发明的范围构成限制，除非声明。不应将本说明书中的语言解释为表 明任何未要求保护的组分对实施本发明是必要的。
[0220] 在权利要求中使用语言"由…组成"或"基本上由…组成"可进一步限定本文公开 的特定实施方案。当在权利要求中使用时，当提交或每次修正添加时，过渡性术语"由…组 成"不包括权利要求中没有具体说明的任何组分、步骤或成分。过渡性术语"基本上由…组 成"将权利要求的范围限制为特定物质或步骤以及没有实质性影响基本特征和新特征的那 些。要求保护的本发明的实施方案是本文固有的或清楚描述的和能够实现的。
[0221] 为描述和公开，本说明书中参考和确认的所有专利、专利公布和其它公布单独地 和明确地整体并入本文，例如，可能结合本发明使用的该公布中所描述的组合物和方法学。 在本申请的申请日期之前单独提供这些公布以将其公开。就此而言，任何事情都不应被解 释为承认发明人不享有先于由于在先发明或出于任何其它原因的此类公开。所有关于日期 的说明或关于这些文件的内容的陈述基于申请人可以得到的信息，并不构成任何关于这些 文件的日期或内容的正确性的承认。
【主权项】
1. 硫蒽酮和伏林司他或贝林司他用于制造治疗癌症的药物的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是肺癌、脑癌、中枢神经系统癌症、乳腺 癌、结肠癌、白血病、骨髓瘤、前列腺癌或卵巢癌。3. 根据权利要求2所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。4. 根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗有效量的所述基于噻吨酮的自噬抑制剂 和所述治疗有效量的所述癌症治疗自噬诱导化合物以单次日剂量被施用或分为多于1次日 剂量。5. 根据权利要求4所述的用途，其中所述多于1次日剂量是2次日剂量。6. 根据权利要求1所述的用途，其中所述基于噻吨酮的自噬抑制剂和所述癌症治疗自 噬诱导化合物被口服施用。7. 根据权利要求1所述的用途，其中所述基于噻吨酮的自噬抑制剂和所述癌症治疗自 噬诱导化合物被胃肠外施用。8. 根据权利要求1所述的用途，其中所述基于噻吨酮的自噬抑制剂和所述癌症治疗自 噬诱导化合物以胶囊剂或片剂的形式被施用。9. 根据权利要求1所述的用途，其中所述基于噻吨酮的自噬抑制剂和所述癌症治疗自 噬诱导化合物被施用一个或多个疗程。10. 根据权利要求9所述的用途，其中所述一个疗程包括每4天7次。11. 根据权利要求1所述的用途，其进一步包括施用放射治疗。12. 根据权利要求1所述的用途，其中使用所述基于噻吨酮的自噬抑制剂减轻与癌症相 关的症状的发生不依赖于P53活性。
【专利摘要】本发明提供了治疗癌症的基于噻吨酮的自噬抑制剂疗法。具体地，本发明提供了硫蒽酮和伏林司他或贝林司他用于制造治疗癌症的药物的用途，所述癌症是肺癌、脑癌、中枢神经系统癌症、乳腺癌、结肠癌、白血病、骨髓瘤、前列腺癌或卵巢癌。
【IPC分类】A61K31/382, A61P35/00, A61K31/18, A61K31/167, A61K45/06, A61P35/02
【公开号】CN105616402
【申请号】CN201510882727
【发明人】S·T·纳罗奇, J·S·卡鲁
【申请人】光谱医药公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2011年3月8日
【公告号】CA2789895A1, CN102858328A, EP2544673A1, US8524762, US9000031, US20110275696, US20140106003, WO2011112623A1