的小分子提取物进行超声溶解，超纯水与甲醇的比例为1:4。溶解后过0.22 μ m有机滤膜，即得到两头尖乙醇提取物的样品溶液。
[0046](4)将获得的两头尖乙醇提取物的样品溶液在以填料为反向分离材料C18(粒径8?10 μ m)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为超纯水、B为甲醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为:0?5min，95%A，5%B ;5 ?15min，87% A，13% B ; 15 ?25min，40% A，60% B，25 ?35min，30% A，70% B ；35?45min，25% A, 75% B ；45?55min，0% A，100% B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长:210nm ;进样量:lg ;流速:80mL/min。按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1 (b)所示，收集47-48min洗脱液(LTJ-ET-17峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。
[0047]将以上得到的两头尖提取物组分LTJ-ET-17经过制备液相色谱进一步分离纯化及NMR碳氢谱分析，判定主要是含有单糖或者双糖的五环三萜类物质。
[0048]实施例3:
[0049]本实施例两头尖提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0050](I)两头尖室温阴干处理后，在50°C烘干脱水，然后在_15°C超微粉碎lOmin，即得两头尖超微粉。
[0051](2)取上述两头尖超微粉lKg，加入5L分析乙醇在40°C提取2h，每0.5h搅拌一次，室温静止4h后取上清液滤过除去杂质，收集滤过液，重复3次。将被乙酸乙酯提取过的粉末置阴凉处晾干，称重后，换成乙醇继续按上述方法提取。所得滤过液减压浓缩至膏状并于烘箱65°C干燥处理，即获得两头尖乙醇提取物。
[0052](3)加入5倍体积的超纯水、色谱级甲醇将步骤⑵所得的小分子提取物进行超声溶解，超纯水与甲醇的比例为1:4。溶解后过0.22 μ m有机滤膜，即得到两头尖乙醇提取物的样品溶液。
[0053](4)将获得的两头尖乙醇提取物的样品溶液在以填料为反向分离材料C18(粒径8?10 μ m)的制备色谱上进行分离纯化，采用的分离色谱柱直径为50mm、柱长为250mm，采用A为超纯水、B为甲醇二元流动相体系进行分离纯化；分离纯化的条件为:0?5min，95%A，5%B ;5 ?15min，87% A，13% B ; 15 ?25min，40% A，60% B，25 ?35min，30% A，70% B ；35?45min，25% A, 75% B ；45?55min，0% A，100% B，按照梯度对样品进行洗脱；检测波长:210nm ;进样量:lg ;流速:80mL/min。按照色谱峰进行收集，色谱峰如图1 (c)所示，收集47-48min洗脱液(LTJ-ET-17峰)，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。
[0054]将以上得到的两头尖提取物组分LTJ-ET-17经过制备液相色谱进一步分离纯化及NMR碳氢谱分析，判定主要是含有单糖或者双糖的五环三萜类物质。
[0055]对比图1中(a)、(b)、(c)，可以得出，本发明两头尖提取物的制备方法重复性好，批次间一致性高，可操作程度强，适合工业化推广生产。
[0056]实施例4:抗肺癌活性实验
[0057](I)在5% C02，37°C，饱和湿度下，用F-12K(10% FBS+1 % PS)培养基培养人肺癌A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。
[0058](2)将细胞实时监测仪放入5% CO2, 37°C饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150 μ L F-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Α549细胞悬液345 μ L，至每孔细胞数约2万，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5 μ L稀释好的样品，终浓度设置为50 μ g/mlo用含0.1 % DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，得到在目的组分两头尖提取物作用下的肺癌A549细胞的实时增殖图，试验结果如图2。实验结果说明两头尖乙醇提取物中的组分LTJ-ET-17在浓度为50 μ g/ml时对肺癌A549细胞的增殖具有较好的抑制作用。因此，本发明目的组分两头尖提取物具有开发成抗肝癌药物的潜力。
[0059]两头尖乙醇提取物各试验组分:LTJ-ET-1、LTJ-ET-2、LTJ-ET-3、LTJ-ET-4、LTJ-ET-5、LTJ-ET-6、LTJ-ET-7、LTJ-ET-8、LTJ-ET-9、LTJ-ET-10、LTJ-ET-1U LTJ-ET-12^LTJ-ET-13、LTJ-ET-14、LTJ-ET-15^ LTJ-ET-16、LTJ-ET-17^ LTJ-ET-18、LTJ-ET-19 分别是实施例1中根据图1(a)色谱分离收集的3-4min、4_5min、5.2-6.9min、7.7-9.2min、
9.3-10.5min、10.7-12.5min、17.5-18.7min、19_20.5min、22_24.5min、26.5-27.7min、28.5-30.5min、31.5_33min、34_36min、37_38min、38.5_40min、40.2-42min、47_48min、48.l-50min、50.5-53min 洗脱液。
[0060]本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行抗肝癌活性实验的监测。RTCA实时无标记细胞分析技术是一种基于新型的细胞分析仪而建立的具有实时监测、高信息量、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性等独特优点的检测技术。该细胞分析仪通过嵌在E-plate板上孔底的微电子感应器阻抗变化去感受细胞的有无以及贴壁、黏附和生长程度的改变。在细胞毒性检测中，可实时、直观的反应细胞增殖、存活、凋亡、形态变化等细胞生物学变化。该技术使得细胞实验变得更加省时高效。
[0061]本发明采用RTCA实时无标记细胞分析技术进行体外抗肺癌活性检测，具有实时监测、无需标记、全自动化、高灵敏度和高准确性的优点，可实时、直观得呈现出肺癌细胞增殖、存活、凋亡等细胞生物学变化，使得该细胞实验变得更加省时高效。
[0062]本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取的市售产品。
[0063]以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内D
【主权项】
1.一种两头尖提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)以两头尖为原料，室温阴干处理后，在40?60°C温度下烘干脱水，然后进行超微粉碎处理，获得超微粉； (2)将步骤⑴所得的超微粉按Ig: (4?12)mL的料液比加入乙酸乙酯，提取I?6h，每0.5?Ih搅拌一次，室温静止I?5h后取上清液过滤，收集滤渣重复提取I?3次；将被乙酸乙酯提取过的滤渣置阴凉处晾干，称重后，换成乙醇继续按上述方法提取；合并乙醇提取的上清液，减压浓缩至膏状，获得两头尖小分子乙醇提取物； (3)按质量体积比加入5?10倍的甲醇-水溶液，进行超声溶解，溶解后过有机滤膜，得到两头尖小分子提取物的样品溶液； (4)将步骤(3)获得的样品溶液在填料为C18的反相分离色谱柱上进行分离纯化，采用A为超纯水、B为甲醇的二元流动相体系，分离纯化的条件为:0?5min 95%A_5%B等度洗脱，5 ?15min 87% A_13% B 等度洗脱，15 ?25min 40% A_60% B 等度洗脱，25 ?35min30%4-70%8等度洗脱，35?4511^11 25% A_75% B 等度洗脱，45 ?55min 100% B 等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集47-48min洗脱液，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。2.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中超微粉碎在-20?4°C温度下进行，时间为5?20min。3.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中乙酸乙酯的提取温度为30?70°C温度，乙醇的提取温度为40?70°C温度。4.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中甲醇-水溶液的甲醇与水的体积比为4: 105.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中有机滤膜的孔径为0.22?0.45 μ m。6.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中反相分离色谱柱的直径为50mm、柱长为250mm，C18的粒径为8?10 μ m。7.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中分离纯化时的检测波长为210nm，进样量为lg，流速为80mL/min。8.根据权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)、(4)中减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，工艺条件为温度70°C、真空度0.08Mpa。9.权利要求1所述的两头尖提取物的制备方法得到两头尖提取物在制备抗肺癌药物或抗肺癌保健食品中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种两头尖提取物的制备方法：将两头尖烘干脱水后超微粉碎，加入乙酸乙酯提取，过滤，收集滤渣用乙醇提取，过滤取上清，减压浓缩后加入甲醇-水溶液进行超声溶解，然后在C18反相分离色谱柱分离纯化，采用A超纯水、B甲醇二元流动相，分离条件为0～5min？95％A等度洗脱，5～15min？87％A等度洗脱，15～25min40％A等度洗脱，25～35min？30％A等度洗脱，35～45min？25％A等度洗脱，45～55min100％B等度洗脱，收集47-48min洗脱液，减压浓缩并烘干，得到本发明目的组分两头尖提取物。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，适合工业化大生产。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/71
【公开号】CN105616552
【申请号】CN201410708241
【发明人】张耀洲, 唐楚沉, 马琳, 顾朋嫒, 李聪聪
【申请人】天津耀宇生物技术有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月28日