一种益智叶提取物及其制备方法、应用
【技术领域】 本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种益智叶提取物及其制备方法、应用。
【背景技术】[0002] 糖尿病（DM)是由遗传和环境因素相互作用所导致的复杂的内分泌疾病，即是胰岛素相 对和/或绝对分泌不足(包括0细胞衰变、功能降低或/和胰岛素抵抗)，而引起的糖、蛋 白质、脂肪和继发的水、电解质等一系列代谢紊乱性疾病。常分为型、II型及妊娠期糖尿 病。糖尿病患者可出现葡萄糖耐量降低、高血糖、尿糖及胰岛素释放试验异常，临床表现为 多饮、多食、多尿及体重减轻(三多一少)，即烦渴、易饥、消瘦、疲乏无力等症状。
[0003] 糖尿病引起血糖升高，可以加快葡萄糖的有氧氧化，增强蛋白的非酶糖基化作用 和导致脂代谢异常，使体内存在一定程度的氧化应激和脂质代谢紊乱。氧化应激会使外周 组织对胰岛素的敏感性下降，葡萄糖的利用降低。此外，氧化应激还会加剧胰岛0细胞凋 亡，胰岛细胞数目减少，降低胰岛素的合成与分泌，使糖代谢异常进一步加剧。因此，氧化应 激在糖尿病的病理衍变中起重要作用。可见，高血糖会引起糖尿病患者抗氧化系统紊乱，产 生氧化应激，反过来氧化应激又会影响糖代谢，由此形成恶性循环。
[0004] 益智（WjOiWa Miq.)，系姜科（Zingiberaceae)山姜属（WjOiWa Roxb.)植物，主要分布于我国海南、广东、广西等地。其干燥成熟果实益智（Fructus AlpiniaeOxyphyllae)被誉为四大南药之一，具有十分重要的药用价值，且属于药食同源 品种，因此具有十分广阔的开发前景。益智果实作为一门传统中药，被历版《中国人民共和 国药典》收载，其味辛、性温，归脾、肾经。有温脾止泻，摄唾涎，暖肾，固精缩尿的功能。主治 脾寒泄泻，腹中冷痛，口多唾涎，肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊。
[0005] 近年来，对益智（J力Miq.)的研究报道较多，也更系统，其中主要 是对益智果实的研究。益智果实的传统功效被我国历代中医药学家熟练地运用于临床，而 近年来对其又有了新的进展。现代药理学研究表明，益智果实还具有舒张血管、强心、抗癌、 抗过敏、抗氧化、抗衰老、抗溃疡、镇静、镇痛、提高免疫力以及神经保护等多方面药理活性。 益智果实中主要成分为倍半萜类、其次为黄酮类、二芳基庚烷类、留醇及其苷类化合物。
[0006] 查阅大量文献可发现，对益智的叶子研究报道较少。益智为多年生草本植物，每年 结果后大量的茎叶部位废弃不用，结果五、六年后益智结果能力开始衰退，导致了资源不能 合理利用。张俊清等对不同生长期益智果实、根茎及茎叶中化学成分的研究发现，在果实整 个生长周期，二苯基庚烷类、萜类等化学性成分主要富集在益智果实中，而黄酮类化学成分 基本均匀分布在益智的果实、根茎及茎叶中。易美华等研究发现，经提取挥发油后的益智果 实及其茎、叶的提取物对猪油脂质均有较强的抗氧化作用；且均对超氧阴离子自由基有清 除作用，清除能力依次为：益智的叶、益智的茎、提取挥发油后的益智果实。但关于治疗糖尿 病方面的研究并未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种具有预防、治疗糖尿病作用的益智叶提取物，同时提供该 提取物的制备方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种益智叶提取物的制备方法，包括以下步骤：取益智叶，加入乙醇，加热提取，提取的 液体经浓缩干燥得乙醇总浸膏；将乙醇总浸膏分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁 醇萃取，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇 部位萃取物。
[0009] 乙醇的浓度为60-75V%，加热提取时温度控制在50-60°C，提取3次，每次l-3h。
[0010] 根据上述制备方法制得的益智叶提取物，为益智叶的石油醚部位萃取物、乙酸乙 酯部位萃取物和/或正丁醇部位萃取物。
[0011] 益智叶提取物在制备预防、治疗糖尿病药物或保健品方面的应用。
[0012] 本发明为证实上述益智叶提取物的降糖作用，采用了体外a _葡萄糖苷酶活性抑 制作用，选择抑制活性好的溶剂萃取物进行体内实验，体内采用的是四氧嘧啶诱导小鼠糖 尿病模型。体外结合体内实验，主要检测了糖尿病小鼠的血糖值(给药前空腹血糖、给药后 空腹血糖、给药后餐后血糖)、肝糖原含量、血清中丙二醛(MDA )含量、超氧化物歧化酶（S0D ) 活力等生化指标，共同考查其对糖尿病的预防、治疗作用。结果表明，益智叶乙酸乙酯部位 萃取物及正丁醇部位萃取物，在体外和体内均有一定降糖作用。
【附图说明】
[0013] 图1为益智叶不同萃取物不同浓度对a-葡萄糖苷酶活性的影响； 图2位益智叶不同萃取物不同剂量对小鼠体重的影响。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1 : 益智叶提取物由以下方法获得：取3400 g干燥益智叶，剪碎后，加入75V%乙醇，55°C提 取3次，每次3 h，每次加入的乙醇体积均以完全浸没益智叶为准，过滤，合并滤液，浓缩干 燥即得益智叶乙醇总浸膏(提取率为23. 33%);将此总浸膏分散于少量水中，依次用等体积 的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别收集萃取液，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚 部位萃取物(提取率1. 41%)、乙酸乙酯部位萃取物(提取率9. 42%)和正丁醇部位萃取物(提 取率 11. 71%)。
[0015] 实施例2 : 益智叶提取物由以下方法获得：取3400 g干燥益智叶，剪碎后，加入70V%乙醇，50°C提 取3次，每次2h，每次加入的乙醇体积均以完全浸没益智叶为准，过滤，合并滤液，浓缩干燥 即得益智叶乙醇总浸膏；将此总浸膏分散于少量水中，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、 正丁醇萃取，分别收集萃取液，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物(提取率 1. 23%)、乙酸乙酯部位萃取物(提取率10. 11%)和正丁醇部位萃取物(提取率11. 08%)。
[0016] 实施例3: 益智叶提取物由以下方法获得：取3400 g干燥益智叶，剪碎后，加入60V%乙醇，60°C提 取3次，每次lh，每次加入的乙醇体积均以完全浸没益智叶为准，过滤，合并滤液，浓缩干燥 即得益智叶乙醇总浸膏；将此总浸膏分散于少量水中，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、 正丁醇萃取，分别收集萃取液，各个萃取液挥干溶剂，分别得到石油醚部位萃取物(提取率 1. 53%)、乙酸乙酯部位萃取物(提取率9. 65%)和正丁醇部位萃取物(提取率10. 96%)。
[0017] 效果实验一：益智叶不同萃取物的体外抑酶活性试验 本发明选用的是以4-硝基酚-a -D-吡喃葡萄糖苷为底物的酶抑制剂筛选模型，体外 考察对a-葡萄糖苷酶活性抑制作用。
[0018] 样品溶液的配制 分别称取实施例1制得的一定质量的石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物、正丁 醇部位萃取物，加入一定体积的DMS0,配成初浓度为30 mg/mL的样品溶液。
[0019] 阳性参考药物阿卡波糖的配制同各萃取物。
[0020] 检测方法及数据处理 实验组设置如下： 空白对照组：8 y L DMS0+152 y L磷酸钾缓冲液，于405 nm波长下测0D值； 空白组：8 yLDMSO+112 yL磷酸钾缓冲液+20 yL 〇?-葡萄糖苷酶+20 yLPNPG， 于405 nm波长下测0D值； 样品对照组：8 y L样品溶液(含阿卡波糖）+152 y L磷酸钾缓冲液，于405 nm波长下 测0D值； 样品组：8 y L样品溶液(分别含石油醚部位萃取物、乙酸乙酯部位萃取物、正丁醇部 位萃取物）+20 yL a-葡萄糖苷酶+112 yL磷酸钾缓冲液+20 yLPNPG，反应结束后于 405 nm波长下测0D值；（具体过程：112 yL磷酸钾缓冲液（pH 6. 8)，加入浓度为0.2 U/ 11^〇'-葡萄糖苷酶2〇1^、8 1^相应浓度的样品溶液，37°(：恒温15 111111，加入2〇1^2.5 mmol/L PNPG，37°C恒温反应15 min。再加入80 yL、浓度为0. 2 mol/L的终止剂似20)3溶 液，于405 nm波长下测0D值。) 同时做相同体系下的空白对照组、空白组、样品对照组、样品组，每组重复3次，按下面 计算公式计算抑制率，并用Origin 6. 0软件求出相应的IC5。值。
[0021] 分别采用上述方法测定了益智叶石油醚部位萃取物、乙酸乙部位酯萃取物和正丁部 位醇萃取物，及阳性参考药物阿卡波糖等试样的抑制率及IC5。值。
[0022] 实验结果
注：NT :未测定。
[0023] 阿卡波糖为阳性参考药物。
[0024] 由表1可看到，在体系浓度达到1500Pg/mL时，益智叶石油醚部位萃取物对a-葡 萄糖苷酶活性的抑制率仅为37. 52 ± 1. 40%，并未达到50%，因此并未测出其IC5。值，且也 并未在图1中显示出其趋势图。表1中，在体系终浓度为1500 Pg/mL时，益智叶乙酸乙酯 部位萃取物和其正丁醇部位萃取物的抑制率（101. 13 ± 1.51%，91. 44 ± 1.55%)均大于 阳性参考药物阿卡波糖（62.62 ± 2. 21%)，且前两者的活性（IC5Q=55.00 ± 0. 23吨/mL， 345. 70 ± 2. 51 Pg/mL)也均大于阳性参考药物阿卡波糖（IC5(]=1130. 00 ± 52. 94吨/ mL)。由表1和图1可看到，乙酸乙酯部位萃取物对a -葡萄糖苷酶活性的抑制作用最好， 其次是正丁醇部位萃取物。
[0025] 效果实验二：益智叶不同萃取物对糖尿病小鼠的影响 2. 1实验方法 小鼠糖尿病模型实验方法，采用的是四氧嘧啶（alloxan)诱导小鼠致糖尿病，其作用 机制主要是选择性损伤胰腺0细胞，引起细胞坏死，导致血胰岛素不同程度下降伴血糖升 高，形成糖尿病。雄性KM小鼠90只，体重16~20 g，自由采食与进水，喂养一周适应环 境后，体重达到25±2 g，分组染色，禁食不禁水10 h后，尾静脉注射四氧嘧啶（80 mg/kg b.w.)，诱导小鼠胰岛0细胞损伤，从而形成糖尿病模型。
[0026] 72 h后，小鼠内眦取血，离心，测定其空腹血糖值(表2)，血糖值大于16. 7 mmol/ L时，作为造模成功的标准。选择造模成功的小鼠，按照血糖值均衡原则随机分配7组，每 组10只，再次染色称重。根据体外实验结果，选择活性好的萃取部位进行体内实验，因此共 设7组