C水浴摇床中振荡消化180min。加入30mL的DMEM/F12， 反复吹打，细胞筛过滤，收集滤液。滤液用1000转/min离心10min，弃上清，将离心沉淀下来 的细胞按I X IO6AiL的密度用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接种于培养瓶中，移入培养 箱中进行培养。次日首次换液，以后每3d换液1次。
[0061 ] S3a、传代培养
[0062]当细胞达融合后，用胰蛋白酶（胰蛋白酶溶液配制：PBS缓冲液200mL，胰蛋白酶 0.5g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化进行传代纯化，至获得第三代间充质干细胞。
[0063]血小板血浆裂解液的制备过程包括以下步骤：
[0064] Slb、无菌条件下用含lOOU/ml低分子量肝素钠的无菌针管从髂后上脊取骨髓 30ml，生物安全柜中转入50ml的无菌离心管中，在200g/min的条件下离心6min，离心后可见 骨髓分为3层，吸取上层及中间富含有核细胞层至另一离心管，1000 g离心6min，弃上清液； 下层加入DMEM培养液(含体积分数为10%血清+8U/ml强力霉素+3U/ml肝素），于37°C，体积 分数为5 % CO2饱和湿度培养箱中原代培养。
[0065] S2b、取原代培养后的细胞悬液于200g条件下离心5分钟，吸取上层血浆和下层2~ 3mm红细胞层进行第二次离心200g，离心5分钟，取上层血浆和下层Imm红细胞层进行第三次 离心800g，离心10分钟，至细胞液分三层，弃上层大部分血清，将剩余血清、白膜样物质层和 下层细胞混匀后置于_80°C冰箱内保存，第二天取出，为防止蛋白质沉淀，在37°C恒温水浴 中解冻时间不能超过5分钟，反复冻存解冻至少3次以上便可得到血小板血浆裂解液。
[0066] 实施例2
[0067] 本实施例提供的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，包括以下成分，且各成分在细 胞制剂中的浓度如下：
[0068] 间充质干细胞2X IO7个/ml;
[0069] 血小板血浆裂解液5 %;
[0070] 人血清蛋白20mg/ml;
[0071] 柠檬酸钠调节注射剂PH=5.0;
[0072] 氯化钠 0.1mol/L;
[0073] 法舒地尔 5ymol/L;
[0074] 强力霉素 lU/mL。
[0075] 其中，间充质干细胞和血小板血浆裂解液的来源过程与实施例1基本相同。
[0076] 实施例3
[0077] 本实施例提供的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，包括以下成分，且各成分在细 胞制剂中的浓度如下：
[0078] 间充质干细胞8X IO7个/ml;
[0079] 血小板血浆裂解液20 %;
[0080] 人血清蛋白80mg/ml;
[00811柠檬酸钠调节注射剂PH=6.0;
[0082] 氯化钠 0.5mol/L;
[0083] 法舒地尔 lOymol/L;
[0084] 强力霉素 lOT/mL。
[0085] 其中，间充质干细胞和血小板血浆裂解液的来源过程与实施例1基本相同。
[0086]为进一步验证本发明提供的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂的显著效果，通过以 下实验及实验数据进行具体说明。
[0087]实验动物分组和模型构建
[0088] SD免疫缺陷鼠，雌雄各半，体重约200~250g，随机分为对照组(注射未加入其他的 单纯干细胞制剂)和治疗组1_3(分别注射对应本发明中实施例1-3)。通过化学方法灼伤建 立皮肤损伤模型，分别隔离相同环境下饲养。以上各组治疗开始后，分别于3d、7d、14d观察 伤口愈合情况，计算伤口愈合指数(WCI): WCI ( % ) = (1-现创面面积/原创面面积）X 100 %， 结果如下表1:
[0089]表1
[0091] 实验结果：由表1数据可知，治疗组1~3皮肤伤口愈合面积远远大于对照组，且治 疗组1~3的皮肤伤口愈合速度较快；由此可知，通过本发明提供的干细胞制剂能够提高皮 肤伤口愈合的效率，能够快速实现修复皮肤溃疡的目的。
[0092] 综上所述，本发明提供的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，通过采用间充质干细 胞结合外源性细胞因子共同制成干细胞制剂，使得间充质干细胞能够定向向内皮细胞分 化，而外源性细胞因子能够刺激内皮细胞的生长，增加创面中成纤维细胞、毛细血管的生成 以及胶原合成和肉芽的生长，并能够增加皮肤角化细胞及内皮细胞的增殖，从而能够实现 快速修复因溃疡损伤的皮肤的目的。
[0093] 以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，包括间充质干细胞和外源性细 胞因子。2. 根据权利要求1所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制 剂中，所述间充质干细胞的浓度为(2~8) X107个/ml。3. 根据权利要求1所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述外源性细 胞因子包括成纤维细胞生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、血 管内皮生长因子、血小板源生长因子、类胰岛素生长因子和P物质。4. 根据权利要求1所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述外源性细 胞因子来源于血小板血浆裂解液。5. 根据权利要求4所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述血小板血 浆裂解液的制备过程包括以下步骤： 无菌条件下，取骨髓，加入肝素钠抗凝，离心至骨髓分层，取下层细胞层，加入标准培养 基进行原代培养;取原代培养后的细胞悬液离心后吸取上层血浆和下层红细胞进行第二次 离心，再次取上层血浆和下层红细胞进行第三次离心，弃上清液后，混匀，置于-50~-80°C 保存，24~36小时后取出，水浴解冻，反复冻存解冻至少三次，即可获得血小板血浆裂解液。6. 根据权利要求5所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述标准培养 基为含有体积分数为5~15%血清、浓度为2~15U/ml的强力霉素以及1~5U/ml肝素的DMEM 培养基。7. 根据权利要求6所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制 剂中，所述血小板血浆裂解液的体积分数为5~20%。8. 根据权利要求1所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干 细胞的获取过程包括以下步骤： 获取脐带，于无菌条件下去除动静脉及外膜，PBS清洗，剪成段，再次清洗去除血液，然 后处理成肉糜状，水浴消化后，加入基础培养基反复吹打，过滤，收集滤液离心，弃上清，将 沉淀的细胞接种于完全培养基中进行培养，次日首次换液，之后每2~3天换液一次;待细胞 融合，不完全消化后，进行传代纯化，获得第三代间充质干细胞完全消化后，继续进行传代 培养。9. 根据权利要求1所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，所述干细胞制 剂还包括20~80mg/ml的血清蛋白、梓檬酸钠、0.1~0.5mol/L的氯化钠和5~15ymol/L法舒 地尔。10. 根据权利要求1所述的用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，其特征在于，还包括1~ 15U/mL的强力霉素。
【专利摘要】本发明涉及一种用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂，包括间充质干细胞和外源性细胞因子。通过采用间充质干细胞结合外源性细胞因子共同制成干细胞制剂，使得间充质干细胞能够定向向内皮细胞分化，并通过间充质干细胞的旁分泌及外源性细胞因子能够刺激内皮细胞的生长，增加创面中成纤维细胞、毛细血管的生成以及胶原合成和肉芽的生长，并能够增加皮肤角化细胞及内皮细胞的增殖，从而能够实现快速有效修复因溃疡损伤的皮肤的目的。
【IPC分类】A61K31/194, A61K31/551, A61K38/38, A61K35/28, A61K33/14, A61K35/17, A61K31/65, A61P17/02
【公开号】CN105708860
【申请号】CN201610051116
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年1月26日