记忆损伤小 鼠海马内TNF-α水平的影响。###ρ〈〇·〇〇1，与saline组比较；#ρ〈0·01，*#ρ〈0·001，与 LPS组比较。
【具体实施方式】
[0080] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，具有SEQ ID N0. :1所示序列 的单克隆抗体虽然分子量大，但是居然能够非常有效地透过血脑屏障，从而对神经退行性 疾病具有良好的治疗作用。具体地，本发明人发现在神经炎症模型小鼠中，通过腹腔注射给 药的本发明单克隆抗体和相应制剂能够有效地抑制动物脑部小胶质细胞活化和小鼠学习 记忆能力的损伤。实验证明，本发明单克隆抗体通过抑制炎症因子与其受体结合来达到对 神经退行性疾病的治疗作用，效果与阳性对照组相当，且该作用具有显著的剂量依赖性。此 外，本发明单克隆抗体还能够有效地中和TNF-α介导的细胞毒作用。
[0081] 此外，本发明还对药物组合物进行改进，结果发现，抗TNF-α抗体（即SEQ ID NO. :1所示序列的单克隆抗体）与特定浓度的含组氨酸的缓冲体系、多元醇（如甘露醇或 山梨醇）、氯化钠以及表面活性剂（如聚山梨酯）组成的液体制剂在pH为5. 5-6. 5的条件 下，不仅在外观、蛋白浓度、浊度、纯度等方面保持优异的稳定性，而且制剂的化学稳定性得 到显著地提高，制剂中电荷异构体的生成速率明显降低，制剂的存放时间得到有效延长。由 于该特定制剂的稳定性好、杂质低且不含易引起不良反应的柠檬酸等物质，因此可消除或 减轻患者的注射部位不良反应，提高病人的用药舒适度。在此基础上，完成了本发明。
[0082] 单克隆抗体
[0083] 如本文所用，术语"重组人抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体"、"本发明单克隆抗 体"、"抗TNF-a抗体"、"抗TNF-a单克隆抗体"可互换使用，均指序列为如SEQ ID N0. :1 所示的单克隆抗体。
[0084] 活性成分
[0085] 本发明的活性成分是指具有如SEQ ID N0. :1所示氨基酸序列的单克隆抗体，对神 经退行性疾病有显著的治疗作用。
[0086] 此外，所述术语还包括具有与治疗神经退行性疾病功能的、SEQ ID N0 :1序列的变 异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：对SEQ ID N0. :1所示的序列进行1-10个，较 佳地为1-5个，更佳地为1-3个氨基酸的替换、添加或删除。应理解，通常，在C末端和/或 N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常不会改变蛋白质的结构和功能。对本发明SEQ ID NO. : 1所示序列的氨基端或羧基端分别进行1-10个氨基酸的添加，并不会影响本发明多肽 的基本功能。
[0087] 在实际应用中，还可对本发明单克隆抗体进行进一步修饰以加强其稳定性。优选 的例子包括对所述多肽加入保护基团，如乙酰基、叔丁氧羰基等。
[0088] 本发明还包括附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（与前导序列、 分泌序列或6His等标签序列融合而形成的衍生蛋白）。根据本文的教导，这些片段、衍生物 和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0089] 发明还提供本发明多克隆抗体的类似物。这些类似物与本发明多克隆抗体的差别 可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类 似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然 存在的或合成的氨基酸（如β、氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上 述例举的代表性的多肽。
[0090] 药物组合物和施用方法
[0091 ] 本发明的药物组合物包含安全有效量的本发明的单克隆抗体以及药理上可接受 的赋形剂或载体。
[0092] 其中，"安全有效量"指的是：单克隆抗体的量足以明显改善病情，而不至于产生严 重的副作用。通常，药物组合物含有〇. l-l〇〇mg/kg本发明的单克隆抗体/剂，更佳地，含有 0. 3-30mg/kg本发明单克隆抗体/剂。较佳地，所述的"一剂"为一个安瓿。
[0093] "药学上可以接受的载体"指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物 质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。"相容性"在此指的是组合 物中各组份能和本发明的单克隆抗体以及它们之间相互掺和，而不明显降低单克隆抗体的 药效。
[0094] 本发明的单克隆抗体或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式 包括（但并不限于）：肠胃外给药（如腹腔内注射剂、皮下注射剂和静脉注射剂等）。
[0095] 用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、 悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和 非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0096] 本发明单克隆抗体可以单独给药，或者与其他药学上可接受的药物联合给药。
[0097] 使用药物组合物时，是将安全有效量的活性成分适用于需要治疗的哺乳动物（如 人），其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，给药剂量通常为20-100mg/次，优选 40-80mg/次，每1-4周给药1次，优选每2周给药1次。当然，具体剂量还应考虑给药途 径、患者病情等因素。
[0098] 高稳定性的液体制剂
[0099] 本发明还提供了一种适用于治疗神经退行性疾病抗体液体制剂，它主要包括以下 组分或由以下组分构成：
[0100] ⑴治疗有效量的抗TNF-α抗体（即SEQ ID NO. : 1所示序列的单克隆抗体）；
[0101] (ii)含〇· 8-6. 2mg/ml组氨酸的缓冲体系；
[0102] (iii)渗透压调节剂；和
[0103] (iv)表面活性剂。
[0104] 其中，可用于本发明制剂中的抗TNF-a抗体包括单克隆抗体，重组抗体，单链抗 体，杂合抗体，嵌合抗体，人源化抗体，或它们的片段。还可以使用包括一个或两个用于结 合抗原的结合位点和免疫球蛋白的Fc-部分的抗体分子。本发明优选为单克隆抗体，本 发明所述的抗TNF-a单克隆抗体可来源以下文献：Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen Biotechnology(N Y). 1994,12(9) :899-903)和专利：CN 1935260B。通过本领域所公知的 方法进行制备，也可以选用其它基因工程技术获得的抗TNF-α单克隆抗体。一类优选的由 其它基因工程技术获得的抗TNF-α单克隆抗体包括阿达木单抗（adalimumab)、英夫利昔 单抗（infliximab)、戈利木单抗（Golimumab)等。用于本发明制剂中的优选抗体是人抗体， 它是从人细胞或从代表人抗体所有组成成分的基因文库中克隆的。特别优选的人抗体是针 对抗原TNF- α，包括人TNF- α (或hTNF α )的抗体。
[0105] 存在于本发明制剂中的抗体的治疗有效量是通过考虑需要的剂量体积和施用模 式决定的。在本发明中，抗体的浓度为40-60mg/ml，优选45-55mg/ml，更优选为48-52mg/ ml，最优选为50mg/ml。本发明包括使用上述任意值的组合作为上限和/或下限的值的范 围。
[0106] 用于本发明制剂中的缓冲体系为包含组氨酸的缓冲体系，该缓冲体系中组氨酸可 以单独存在，或以以下形式存在，如组氨酸盐酸盐、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐、组氨酸硫 酸盐等。在一个优选实施方案中，缓冲体系中的组氨酸单独存在或以组氨酸盐酸盐形式存 在。
[0107] 本发明的渗透压调节剂主要由多元醇和氯化钠组成，其中"多元醇"是具有多个羟 基的物质，并且包括糖（还原糖和非还原糖），糖醇和糖酸。"还原糖"是包括半缩醛基的糖， 它能够还原金属离子或与蛋白中的赖氨酸和其他氨基共价反应，而"非还原糖"是不具备还 原糖的上述特征的糖。还原糖的例子包括果糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，阿拉伯糖，木糖。非 还原糖包括蔗糖，海藻糖，山梨糖，松三糖和棉子糖。糖醇的例子包括甘露糖醇，木糖醇，赤 藓糖醇，苏糖醇，山梨糖醇和甘油。至于糖酸，包括L-葡糖酸和它的金属盐。如果需要所述 制剂是冻-融稳定的，所述多元醇优选是在冷冻温度（例如，-20°C)下不会结晶的，以便它 使所述制剂中的抗体去稳定化。
[0108] 多元醇的用量可以根据所需要的制剂的等渗性而改变。本发明的制剂优选是等渗 透的。所添加的多元醇的量还可以根据多元醇的分子量而改变。本发明优选的多元醇为 糖醇。在本发明的优选实施方案中，多元醇为甘露醇或山梨醇，甘露醇或山梨醇的浓度为 8-20mg/ml，更优选为l〇-15mg/ml，更优选为ll-13mg/ml，本发明包括使用上述任意值的组 合作为上限和/或下限的值的范围。
[0109] 氯化钠的浓度为2-10mg/ml，优选为4_8mg/ml，更优选为5. 5-6. 5mg/ml。
[oho] 本发明制剂中的表面活性剂优选非离子表面活性剂，如失水山梨醇聚氧乙烯醚脂 肪酸酯（例如失水山梨醇聚氧乙烯（20)醚月桂酸酯，失水山梨醇聚氧乙烯（20)醚油酸酯 等）或泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188)。所添加的表面活性剂的量使其能减少制剂中的抗 体的聚集和/或减少颗粒在制剂中的形成和/或减少吸附。在本发明的优选的表面活性剂 为聚山梨酯，如吐温80。在一优选的实施方案中，聚山梨酯的浓度为0. 6-1. Omg/ml，优选为 0. 8-1. Omg/ml，更优选为0. 9-1. Omg/ml。本发明包括使用上述任意值的组合作为上限和/ 或下限的值的范围。
[0111] 本发明通过缓冲体系来调节制剂的pH值，以控制pH在5. 5-6. 5的范围内，在某些 实施方案中，制剂的pH处于5. 5至6. 4、5. 6至6. 3、5. 7至6. 2、5. 8至6. 1、5. 9至6. 0之间， 本发明包括使用上述任意值的组合作为上限和/或下限的值的范围。在一些优选的实施方 案中，制剂 pH 为 5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4 或 6. 5。
[0112] 应理解，本发明的缓冲体系除包括组氨酸以外，还可进一步包括一种或多种其他 缓冲组分，通过与其他缓冲组分的组合将制剂的pH值控制在上述范围。适合的其他缓冲组 分包括柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐（例如乙酸钠），琥珀酸盐（例如琥珀酸钠）等。
[0113] 本发明优选的实施方案中，缓冲体系为组氨酸一盐酸，其中组氨酸浓度为 0· 8-6. 2mg/ml，优选为1. 6-5. Omg/ml，更优选为3. 0-3. 8mg/ml。本发明包括使用上述任意 值的组合作为上限和/或下限的值的范围。在另一种实施方案中，所述制剂的pH是用柠檬 酸、乙酸或磷酸等无机酸调节的。
[0114] 发明人经过大量的实验和数据筛选发现，当本发明制剂中组氨酸的浓度低于 0. 8mg/ml时，缓冲体系的缓冲能力将受到明显的限制，当组氨酸的浓度高于6. 2mg/ml时， 对制剂稳定性并无提高作用，并且可能引起不良反应。
[0115] 此外，发明人经过反复的试验，对各类缓冲体系的组分及含量进行了大量的筛选， 并最终从大量的缓冲体系中筛选得到了本发明的组氨酸体系，并且发现在该体系中，抗体 蛋白的稳定性明显提高。
[0116] 本发明的制剂中可包括一种或多种其它药学可接受载体、赋