3%过 氧化氢溶液灭活。山羊血清封闭后加入兔抗小鼠 Iba-Ι-抗溶液，4°C孵育过夜。次日平衡 至室温后弃一抗溶液，洗涤后滴加生物素偶联山羊抗兔二抗溶液，室温孵育后弃二抗溶液， 洗涤，滴加亲和素偶联辣根过氧化物酶复合物溶液，室温孵育后弃亲和素偶联辣根过氧化 物酶复合物溶液，洗涤，滴加底物显色液，显色后洗涤，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树 胶封片，显微镜下观察并拍照，Image-Plus软件统计分析。
[0227] 3.统计分析
[0228] 采用spss 13. Ofor windows软件进行单因素方差分析结合t检验，p〈0. 05认为 具有统计学差异。
[0229] 4.实验结果
[0230] (1)重组人抗肿瘤坏死因子-a单克隆抗体对小鼠在Y迷宫中学习记忆能力的影 响
[0231] 实验结果表明，LPS能够明显降低小鼠在Y迷宫中的自发交替反应率，重组人抗肿 瘤坏死因子-ct单克隆抗体能够剂量依赖性的增加小鼠的自发交替反应率，在15和50mg/ kg剂量下具有明显的统计学意义，阳性对照药米诺环素也能够明显增加小鼠的自发交替反 应率。LPS、重组人抗肿瘤坏死因子-a单克隆抗体和米诺环素对小鼠在Y迷宫中的总进壁 次数没有明显影响（见图8)。
[0232] (2)重组人抗肿瘤坏死因子-a单克隆抗体对小胶质细胞增殖和活化的影响
[0233] 实验结果表明，小鼠侧脑室注射LPS后海马内IBA-1阳性的小胶质细胞数量明显 增加（图9B)，重组人抗肿瘤坏死因子-a单克隆抗体能够剂量依赖性的减少海马内小胶质 细胞的数量（图9C、D、E)，在15和50mg/kg剂量下具有明显的统计学意义，阳性对照药米 诺环素也能够明显减少海马内小胶质细胞的数量（图9F)。
[0234] (3)重组人抗肿瘤坏死因子-a单克隆抗体对TNF-a释放的影响
[0235] 实验结果表明，LPS能够明显增加小鼠海马内TNF-a的水平，重组人抗肿瘤坏死 因子-a单克隆抗体能够剂量依赖性的降低小鼠海马内的TNF- a水平，在15和50mg/kg剂 量下具有明显的统计学意义，阳性药物米诺环素也能够明显降低海马内TNF-a的水平（见 图 10)。
[0236] 在实施例7-8中，通用方法和设备如下：
[0237] IEC测试方法
[0238] 按照《中华人民共和国药典》(2010年版，三部）附录III B进行测定，用弱阳离子交 换柱 Thermo WCX-104. 0 X 250mm 色谱柱，保护柱为 Thermo WCX-10G4. 0 X 50_，流动相 A、B 进行梯度洗脱（A :10mM NaH2P04 ·2Η20 pH 7. 5 ;B :10mM NaH2P04 ·2Η20+500ι?Μ NaCl pH 7. 5)。 流速1. 0ml/分钟，检测波长280nm，柱温35°C，连续进样2次，进样量100 μ g。
[0239] 设备：美国安捷伦1260高效液相色谱分析仪
[0240] 本发明以下实施例、对比例中的液体抗体制剂通过常规方法，将各组分进行混合 来制备。
[0241] 以下实施例中的抗TNF-α单克隆抗体的分子来源参见文献：Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen Biotechnology (N Y). 1994,12 (9) :899-903)和专利：CN 1935260 B。采用本领域公知的抗体制备工艺，经过基因工程细胞培养，Protein A层析及其它分离 纯化步骤精制而成。
[0242] 实施例7
[0243] 制剂中各组分与含量如表1所示：
[0244] 表 1
[0245] 抗TNF-α单克隆抗体 50mg/m_l 组氨酸 3.4mg/ml 山梨醇 12mg/ml 氯化钠 6mg/ml
[0246] 聚山梨酯 80 lmg/ml pH 6 0
[0247] 实施例8
[0248] 制剂中各组分与含量如表2所示：
[0249] 表 2
[0250] 抗TNF- α单克隆抗体 50mg/ml 组氨酸 3. 4mg/ml 甘露醇 12mg/ml 氯化钠 6mg/ml 聚山梨酯80 lmg/ml pH 6,0
[0251] 对比例1
[0252] 制剂中各组分与含量如表3所示：
[0253] 表 3
[0254] 抗TNF- ct单克隆抗体 50mg/ml 梓檬酸 1.3mg/ml 柠檬酸钠 0. 3mg/ml 二水合磷酸氢二钠 1.5mg/ml 二水合磷酸二氢钠 0. 9mg/ml 甘露糖醇 12mg/ml 氯化钠 6. 2mg/ml 聚山梨酯80 lmg/ml pH 5 0
[0255] 通过高效阳离子交换色谱（IEC-HPLC)表征抗TNF-α单克隆抗体的化学稳定性， 以IEC-HPLC主峰下降和酸性组分上升百分比作为判定手段，测试结果见表4和表5。
[0256] 表4 37°C ±2°C蛋白电荷异构变化结果（IEC主峰下降百分比）
[0257]
[0258] 表5 37°C ±2°C蛋白电荷异构变化结果（IEC酸性组分上升百分比）
[0259]
[0260] 从表4可以看出，与对比例1相比，本发明制剂（实施例7和8)中抗体电荷异构 变化分别在14天和1个月的IEC主峰下降百分比和IEC主峰上升百分比均显著降低，上述 结果表明，制剂中抗体的化学降解反应速率明显降低，抗体的化学稳定性得到了明显提高， 因此提高了产品质量的均一性和一致性，有助于延长抗TNF-α单克隆抗体的货架期。
[0261] 通过对实施例7、实施例8和对比例1的制剂分别进行SEC检测，判断制剂中抗体 纯度的变化，测试结果如表6所示：
[0262] 表6 37°C ±2°C蛋白纯度变化结果（SEC主峰百分比）
[0263]
[0264] 从表6可以看出，本发明制剂（实施例7和8)中抗体分别在0天、14天和1个月 的SEC主峰百分比与对比例的SEC主峰百分比相当，该结果表明，本发明制剂中的抗体任具 有较高的蛋白纯度，保持优异的稳定性。
[0265] 发明人还分别对实施例7、实施例8和对比例1的制剂的其它稳定性指标，包括外 观、蛋白浓度、浊度均进行了测试比较，结果发现上述的稳定性指标均与对比例1中制剂的 指标相当，该结果表明，本发明的制剂保持优异的稳定性。
[0266] 此外，本发明中的制剂由于不含柠檬酸组分，因此可减轻或消除由其引起的病人 注射部位的不良反应，提高病人的用药舒适度。
[0267] 对比例2
[0268] 本对比例中的制剂各组分和含量均与实施例7相同，不同之处在于对比例2中制 剂pH为5.0。
[0269] 对比例3
[0270] 本对比例中的制剂各组分和含量均与实施例7相同，不同之处在于对比例3中制 剂pH为7.0。
[0271] 通过高效阳离子交换色谱（IEC-HPLC)表征本发明的制剂（实施例7)和对比例2 和3制剂中抗TNF-α单克隆抗体的化学稳定性，以IEC-HPLC主峰下降和酸性组分上升百 分比作为判定手段，测试结果见表7。
[0272] 表7 37°C ±2°C下12天的蛋白电荷异构变化结果
[0273]
[0274] 从表7可以看出，与对比例2和3相比，本发明制剂中抗体的IEC主峰下降百分比 和IEC主峰上升百分比均显著降低，上述结果表明，本发明制剂中抗体的化学降解反应速 率明显降低，抗体的化学稳定性得到了明显提高。
[0275] 通过对实施例7、对比例2和对比例3的制剂分别进行SEC检测，判断制剂中抗体 纯度的变化，测试结果如表8所示：
[0276] 表8 37°C ±2°C下的蛋白纯度变化（SEC)
[0277]
[0278] 表8显示了抗体在35_39°C下放置12天后蛋白纯度的变化结果，从上表可以看出， 本发明的制剂在放置12天后，其抗体纯度的下降程度明显低于对比例2和3中的抗体纯度 的下降值。
[0279] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备治疗神经退行性疾病的药物组合物， 其中所述的单克隆抗体具有如SEQ ID NO. :1所示序列。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物含有SEQ ID NO. : 1所示 序列的单克隆抗体，和药学上可接受的载体。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的神经退行性疾病选自下组：阿尔茨海 默病、帕金森氏病和脑中风。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还用于：（i)抑制炎症因 子与受体结合和/或（ii)抑制小胶质细胞的增殖和活化；和/或（iii)抑制炎症因子分 泌。5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物的剂型包括：注射剂、冻 干粉。6. 如权利要求1-5中任一项所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂并 含有： ⑴治疗有效量的抗TNF-α抗体（即SEQ ID NO. :1所示序列的单克隆抗体）； (ii) 含0· 8-6. 2mg/ml组氨酸的缓冲体系； (iii) 渗透压调节剂；以及 (iv) 表面活性剂， 其中，所述制剂的pH为5. 5-6. 5。7. -种治疗神经退行性疾病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有安全 有效量的SEQ ID NO. :1所示序列的单克隆抗体，和药学上可接受的载体。8. -种治疗神经退行性疾病的方法，包括步骤：将具有SEQ ID NO. :1所示序列的单克 隆抗体或其药物组合物施用于需要的对象。9. 一种体外非治疗性的抑制炎症因子分泌的方法，其特征在于，包括步骤： 在SEQ ID NO. :1所示单克隆抗体的存在下，培养细胞，从而抑制所述细胞分泌炎症因 子。10. -种体外非治疗性的抑制小胶质细胞的增殖和/或活化的方法，其特征在于，包括 步骤： 在SEQ ID NO. :1所示单克隆抗体的存在下，培养小胶质细胞，从而抑制所述小胶质细 胞的增殖和/或活化。
【专利摘要】本发明公开了一种单克隆抗体在治疗神经退行性疾病中的应用。具体地，本发明提供了一种单克隆抗体的用途，用于制备治疗神经退行性疾病的药物组合物；其中，所述的单克隆抗体的序列如SEQ ID NO.1所示。实验证明，本发明单克隆抗体和制剂对神经退行性疾病有显著的治疗作用，且该作用具有显著的剂量依赖性。
【IPC分类】A61P9/10, A61K39/395, A61P25/28, C12N5/079, A61P29/00, A61K47/18, A61P25/16
【公开号】CN105727285
【申请号】CN201410757478
【发明人】王春明, 李佳, 俞德超
【申请人】信达生物制药(苏州)有限公司
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2014年12月10日