专利名称：一种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法
技术领域：
本发明介绍了ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，属于纳米材料技术领域。
背景技术：
当今世界飞速发展的纳米技术使得在复杂生物体内精确控制纳米颗粒在特定器官、特定细胞甚至特定细胞器中的定位成为可能 。这其中，在亚细胞水平上，设计具有特定细胞器靶向性的新型功能纳米材料虽具有挑战性，但却具有深远的意义。细胞核是细胞中最重要的细胞器，同时也是许多抗癌药物(如阿霉素、顺钼等)的作用靶点。制备具有细胞核靶向性的功能纳米材料将会对深入研究发生在细胞核中的重大生命活动以及开发针对细胞核的新型诊断以及治疗策略等具有极其重要的作用。然而实现纳米颗粒在亚细胞水平的靶向输送并非易事。因为纳米颗粒要想靶向定位到特定的细胞器，则必须穿越细胞膜等多重障碍，同时在到达特定的细胞器之前，还需要避免被细胞内的清除系统所清除。迄今为止，纳米颗粒的细胞核祀向性大多是通过在颗粒表面修饰细胞核定位信号肽(nuclearlocalization signal peptides,简称NLS)实现的,这一方法要求颗粒表面可以与NLS结合，因而该方法通常仅适用于金或银等可以直接与含巯基的NLS结合的纳米颗粒的细胞核革巴向性。纳米材料的合成大致可以分成油相合成与水相合成两条路线。迄今为止，大多数高质量(如高的结晶度，高的分散性，高的光学、磁学性能等)的纳米材料都是通过油相合成得到的。这些油相中得到的纳米颗粒通常表面都具有疏水性的侧链，不易分散于水相中，所以必须经过转水相处理之后，才可以用于生物体系。利用巯基试剂或者表面活性剂等对纳米颗粒表面进行修饰是实现纳米颗粒转水相的常用方法之一。然而，这些方法都未能在实现转水相的同吋，赋予颗粒细胞核靶向性。季铵盐表面活性剂是ー种常用的阳离子表面活性剤，它是铵盐的4个氢原子被有机基团代替而形成的，具有R4N+X-的结构(其中四个烃基R可以相同，也可不同。X多是卤素负离子(F、Cl、Br、I)，也可是酸根(如HS04、RCOO等))。常用的季铵盐表面活性剂为C12、C14, C16以及C18的单长碳链型季铵盐，主要包括十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基ニ甲基苄基氯化铵、十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵、十八烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵等。2006年RichardW. Horobin等人研究了包括季铵盐表面活性剂在内的阳离子探针具有细胞核靶向性的原因(參考文献=Histochem Cell Biol (2006) 126 :165-175)，并指出阳离子表面活性剂与具有电负性的核酸物质之间高的亲和カ是阳离子表面活性剂趋核性的主要驱动力。同时，季铵盐结构的存在可减少该表面活性剂在非核部位的聚集，进而增强该表面活性剂的细胞核靶向选择性。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中无法实现转水相的同时，赋予颗粒细胞核靶向性；以及在颗粒表面修饰细胞核定位信号肽エ艺复杂的问题，提供了ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法。本发明的目的是通过下述技术方案实现的。本发明的ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，具体步骤如下向含有季铵盐型表面活性剂的水溶液中加入含有疏水性纳米颗粒的有机溶液，并搅拌；所用季铵盐型表面活性剂与疏水性纳米颗粒的摩尔比为1:1 IO6 : 1，所用有机溶液与水溶液的体积比为1:1 1:1O3;然后分离除去多余的表面活性剂分子，最后将转水相后的颗粒与细胞共孵育，发现颗粒能够穿越细胞膜进入细胞质，最終定位到细胞核中。
上述步骤中所用表面活性剂为季铵盐型表面活性剤，其疏水端为含12 18个碳原子的单长碳链，包括十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基ニ甲基苄基氯化铵、十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵、十八烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵等。所选用的疏水性纳米颗粒可以选择磁性纳米颗粒，金纳米颗粒，银纳米颗粒或者量子点等，但要求颗粒的粒径需小于lOOnm，颗粒分散且颗粒表面含油酸等疏水性侧链。有益效果1、本发明的ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，可以实现疏水性纳米颗粒的水相转移。并且相转移之后的纳米颗粒分散性好，水相稳定。相转移后的颗粒的水溶液在4°c下避光存放半年之后，溶液中无沉淀或浑浊出现。更重要的是，相转移前后，纳米颗粒本身的光学及磁学性质均不会有明显的改变。2、本发明的ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，在实现颗粒转水相的同时，还可以赋予颗粒细胞核靶向性。即利用表面活性剂(如十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基ニ甲基苄基氯化铵、十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵、十八烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵等)修饰后，所得纳米颗粒不必再经任何其他修饰或处理，就具有显著的细胞核靶向功能，能够穿过细胞膜进入细胞，并选择性的定位到细胞核中。3、本发明的ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，无需在颗粒表面修饰细胞核定位信号肽就可以实现纳米颗粒的细胞核靶向性，本发明エ艺简单，容易操作。4、本发明的ー种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，纳米颗粒的成功水相转移使得纳米颗粒在生物体系中的应用成为可能。而转水相后纳米颗粒的细胞核靶向性则使该纳米颗粒可以用于细胞核靶向成像，以及靶向细胞核的药物输送。正如背景技术中所谈到的，细胞核是细胞中最重要的细胞器。具有细胞核靶向性的荧光探针必将会在重大疾病的诊断、检测以及治疗等方面发挥重要作用。对于本发明而言，更重要的一点是转水相与细胞核靶向这两个过程仅仅是通过ー步简单的表面活性剂修饰就能同时实现。这ー简单但有效的方法将进ー步增强这类具有细胞核靶向性的纳米材料的生物应用前景。
图1为实施例1中的CdS纳米颗粒在十六烷基三甲基溴化铵修饰之前(a图)和之后(b图)的透射电子显微镜照片；图2为实施例4制备的十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒在HeLa细胞中的核靶向定位的明场(Bright field)照片，共聚焦(CLSM)照片以及两者叠加(Merged)后的照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步的描述，但本发明并不仅仅限制于如下所述的·实施例。实施例1、十六烷基三甲基溴化铵修饰的CdS纳米颗粒的制备。取油酸包覆的CdS纳米晶(平均粒径为3. 2nm，如附图1a所示)的氯仿溶液Iml (其中含有的CdS的浓度为0. 5mg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到30ml十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中(该溶液中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0. 05M)，然后继续磁力搅拌48小时。48小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十六烷基三甲基溴化铵。最終所得十六烷基三甲基溴化铵修饰的CdS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为4.1nm(如附图1b所示)。将十六烷基三甲基溴化铵修饰的CdS纳米颗粒与人肝癌HepG2细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于H印G2细胞的细胞核中。实施例2、十二烷基ニ甲基苄基氯化铵修饰CdS纳米颗粒的制备.取油酸包覆的CdS纳米晶(平均粒径为3. 2nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的CdS的浓度为0. 5mg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到40ml十二烷基ニ甲基苄基氯化铵的水溶液中(该溶液中十二烷基ニ甲基苄基氯化铵的浓度为0. 2M)，然后继续磁力搅拌24小吋。24小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十二烷基ニ甲基苄基氯化铵。最終所得十二烷基ニ甲基苄基氯化铵修饰的CdS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为5. 4nm。将十二烷基ニ甲基苄基氯化铵修饰的CdS纳米颗粒与人肝癌HepG2细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于HepG2细胞的细胞核中。实施例3、十二烷基ニ甲基苄基氯化铵修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒的制备。取油酸包覆的磁性Fe3O4纳米颗粒(平均粒径为5nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的磁性Fe3O4的浓度为5mg/ml),在机械搅拌下,缓缓加入到40ml十二烧基ニ甲基节基氯化铵的水溶液中(该溶液中十二烷基ニ甲基苄基氯化铵的浓度为0. 2M)，然后继续机械搅拌24小吋。24小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十二烷基ニ甲基苄基氯化铵。最終所得十二烷基ニ甲基苄基氯化铵修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为7. 6nm。并且将十二烷基ニ甲基苄基氯化铵修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒与人结直肠癌Caco-2细胞共培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于Caco-2细胞的细胞核中。实施例4、十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒的制备。
取油酸包覆的CuInS2-ZnS纳米颗粒(平均粒径为4nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的CuInS2-ZnS的浓度为0. 3mg/ml)，在机械搅拌下，缓缓加入到30ml十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵的水溶液中(该溶液中十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵的浓度为0. 3M)，然后继续机械搅拌12小吋。12小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵。最終所得十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为6. 6nm。并且将十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒与人宫颈癌HeLa细胞共培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于HeLa细胞的细胞核中，如图2所示。实施例5、十八烷基三甲基溴化铵修饰的Au纳米颗粒的制备。取油酸包覆的Au纳米颗粒(平均粒径为4nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的Au的浓度为0. lmg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到20ml十八烷基三甲基溴化铵的水溶液中(该溶液中十八烷基三甲基溴化铵的浓度为0. 05M)，然后继续磁力搅拌48小吋。48小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基三甲基溴化铵。最終所得十八烷基三甲基溴化铵修饰的Au纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为5. Onm。将十八烷基三甲基溴化铵修饰的Au纳米颗粒与人脐静脉血管内皮HUVEC细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于HUVEC细胞的细胞核中。实施例6、十四烷基三甲基溴化铵(十四烷基三甲基溴化铵)修饰的Cu2InCaSe4纳米颗粒的制备。取油酸包覆的Cu2InCaSe4纳米颗粒(平均粒径为IOOnm)的氯仿溶液Iml (其中含有Cu2InCaSe4的浓度为10mg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到20ml十四烷基三甲基溴化铵的水溶液中(该溶液中十四烷基三甲基溴化铵的浓度为0. 5M)，然后继续磁力搅拌48小吋。48小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十四烷基三甲基溴化铵。最終所得十四烷基三甲基溴化铵修饰的Cu2InCaSe4纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为120nm。将十四烷基三甲基溴化铵修饰的Cu2InCaSe4纳米颗粒与人宫颈癌HeLa细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于HeLa细胞的细胞核中。实施例7、十六烷基三甲基溴化铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒的制备 取油酸包覆的CuInS2-ZnS纳米颗粒(平均粒径为50nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的CuInS2-ZnS的浓度为5mg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到30ml十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中(该溶液中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0. 1M)，然后继续磁力搅拌72小吋。72小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十六烷基三甲基溴化铵。最終所得十六烷基三甲基溴化铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为62nm。将十六烷基三甲基溴化铵修饰的CuInS2-ZnS纳米颗粒与人脐静脉血管内皮HUVEC细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于HUVEC细胞的细胞核中。实施例8、十二烷基三甲基氯化铵修饰的PbS纳米颗粒的制备。取油酸包覆的PbS纳米颗粒(平均粒径为IOnm)的氯仿溶液Iml (其中含有的PbS的浓度为0. lmg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到20ml十二烷基三甲基氯化铵的水溶液中(该溶液中十二烷基三甲基氯化铵的浓度为0. 3M)，然后继续磁力搅拌24小吋。24小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十二烷基三甲基氯化铵。最終所得十二烷基三甲基氯化铵修饰的PbS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为14. 3nm。将十二烷基三甲基氯化铵修饰的PbS纳米颗粒与人肝癌H印G2细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于HepG2细胞的细胞核中。实施例9、十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的PbS纳米颗粒的制备取油酸包覆的PbS纳米颗粒(平均粒径为IOnm)的氯仿溶液Iml (其中含有的PbS的浓度为0. lmg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到30ml十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵的水溶液中(该溶液中十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵的浓度为0. 2M)，然后继续磁力搅拌48小吋。48小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵。最終所得十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的PbS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为13.6nm。将十八烷基ニ甲基羟こ基硝酸铵修饰的PbS纳米颗粒与人肝癌HepG2细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于 IfepG2细胞的细胞核中。实施例10、十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵修饰的ZnS纳米颗粒的制备。取油酸包覆的ZnS纳米颗粒(平均粒径为18nm)的氯仿溶液Iml (其中含有的ZnS的浓度为0. 05mg/ml)，在磁力搅拌下，缓缓加入到20ml十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵的水溶液中(该溶液中十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵的浓度为0. 2M)，然后继续磁力搅拌24小吋。24小时后，利用截留分子量为IOKDa的超滤离心管多次离心(4000rpm，IOmin/次)以除去多余的十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵。最終所得十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵修饰的ZnS纳米颗粒在水中分散性很好，平均尺寸约为23. 5nm。将十八烷基ニ甲基羟こ基过氯酸铵修饰的ZnS纳米颗粒与人结直肠癌Caco-2细胞共同培养3小时后，发现该纳米颗粒主要存在于Caco-2细胞的细胞核中。
权利要求
1.一种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，其特征在于向含有季铵盐型表面活性剂的水溶液中加入含有疏水性纳米颗粒的有机溶液，并搅拌；所用季铵盐型表面活性剂与疏水性纳米颗粒的摩尔比为1:1 IO6 : 1，所用有机溶液与水溶液的体积比为1:1 1:1O3;然后分离除去多余的表面活性剂分子，最后将转水相后的颗粒与细胞共孵育，发现颗粒能够穿越细胞膜进入细胞质，最终定位到细胞核中。
2.如权利要求1所述的一种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，其特征在于所述表面活性剂为季铵盐型表面活性剂，其疏水端为含12 18个碳原子的单长碳链。
3.如权利要求1或2所述的一种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，其特征在于所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十八烷基二甲基羟乙基硝酸铵、十八烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十八烷基二甲基羟乙基过氯酸铵。
4.如权利要求1所述的一种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，其特征在于所述疏水性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒、金纳米颗粒、银纳米颗粒或者量子点；颗粒的粒径需小于lOOnm，颗粒分散且颗粒表面含油酸等疏水性侧链。
全文摘要
本发明涉及一种使疏水性纳米颗粒同时实现水相转移与细胞核靶向性的方法，属于纳米材料技术领域。其实施步骤简单概括为向含有一定浓度表面活性剂的水溶液中加入适量含有疏水性纳米颗粒的有机溶液，并搅拌适当时间。然后分离除去多余的表面活性剂分子。本发明中所使用的表面活性剂分子其亲水端含有季铵盐。利用该类表面活性剂对疏水性纳米颗粒进行修饰，不仅仅可以实现疏水性纳米颗粒的水相转移，而且转水相之后，无需任何其他修饰或处理，这些纳米颗粒就表现出很明显的细胞核靶向效果。
文档编号C01G9/08GK103011258SQ20121043660
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者曹传宝, 王美娜, 王艳丽, 白驹 申请人:北京理工大学