抗ctla－4抗体的应用的制作方法

专利名称：抗ctla－4抗体的应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及包含抗CTLA-4抗体的组合物和抗CTLA-4抗体应用，该抗体具有来自人基因的氨基酸序列。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一个成员，它能下调T细胞活化并维持免疫学稳态。特别是，据认为CD28和CTLA-4传递相反的信号，该信号由决定对抗原反应的T细胞整合。抗原刺激T细胞受体的结果受CD28协同刺激信号的调节，也受来自CTLA-4的抑制性信号的调节。此结果也由T细胞上的CD28或CTLA-4与在抗原呈递细胞中表达的B7分子之间的相互作用来决定。
Kwon等。PNAS USA 948099-103(1997)证明体内对CTLA-4的抗体介导阻断能增强抗前列腺癌的免疫反应。Yang等。Cancer Res574036-41(1997)，基于体外和体内的研究结果发现在肿瘤携带动物中，CTLA-4阻断能增强其产生抗肿瘤T细胞反应的能力；在此动物模型中，增强效果限于肿瘤生长的早期阶段。Hurwitz等。Proc Natl Acad Sci USA9510067-71(1998)联合使用CTLA-4阻断和一种疫苗(由表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的SM1细胞组成)来促使亲代SM1肿瘤退化，尽管单独使用二者之一治疗都无效。
Allison等的美国专利5,811,097涉及给予CTLA-4阻断剂降低肿瘤细胞生长。WO 00/37504(2000年6月29日公开)涉及人抗CTLA-4抗体及这些抗体在治疗肿瘤中的应用。WO 01/14424(2001年3月1日公开)涉及另外的人抗CTLA-4抗体以及这种抗体在治疗肿瘤中的应用。WO93/00431(1993年1月7日公开)涉及细胞与一种单克隆抗体相互作用的调节，该单克隆抗体能与CTLA4Ig融合蛋白发生反应。WO 00/32231(2000年6月8日公开)涉及一种CTLA-4阻断剂与一种肿瘤疫苗联合使用来刺激T细胞。
发明概述本发明涉及一种治疗哺乳动物癌症的方法，包括给所述哺乳动物施用一定量的人抗CTLA-4抗体，该量能有效治疗所述癌症，其中所述癌选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤(spinal axistumor)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌包括那些由石棉诱导的癌，以及所述癌症的组合。在一个方案中，本方法也包括将所述抗体与选自试剂组的药剂联合给予所述动物，该试剂组由化学治疗剂、癌疫苗、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗血管剂(anti-vascular agent)、信号转导抑制剂、抗增生剂、调亡诱导物和存活途径抑制剂组成。
当抗体与化学治疗剂联合给药时，该药剂可选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalating antibiotic)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节物、抗激素、血管生成抑制剂和抗雄激素。
当抗体与一种信号转导抑制剂联合给药时，该信号转导抑制剂可选自EGFR(表皮生长因子受体)抑制剂、VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂和erbB2受体抑制剂。
然而在另一个实施方案中，实施该方法时，将一定量的所述抗体与放疗联合处理哺乳动物，其中联合放疗的抗体的量能有效抑制哺乳动物的异常细胞生长或治疗过度增生性疾病。该方法也能这样实施，使癌症对放射治疗敏感化，这是通过给哺乳动物施用能有效使所述癌症对放射治疗敏感的量的抗体实现的。本方法优选进一步包括用放射治疗癌症。应该理解的是，通过给予射线，本方法也能够使癌症对抗体治疗敏感。
在一个优选实施方案中，哺乳动物是人。
在一个实施方案中，与CTLA-4结合的抗体有下列特性与CTLA-4的结合亲和力为大约10-9或更高；抑制CTLA-4和B7-1之间结合的IC50为大约100nM或更低；抑制CTLA-4和B7-2之间结合的IC50为大约100nM或更低；在人T细胞试验中增加IL-2产生500pg/ml或更多；并含有包含人FR1、FR2和FR3氨基酸序列的重链氨基酸序列，该人FR1、FR2和FR3氨基酸序列对应于VH3-33基因的那些，或其中发生保守替代或体细胞突变，其中FR序列与CDR1、CDR2和CDR3序列相连。该抗体的轻链中也可包含来自A27或O12基因的CDR区。
本发明的其它实施方案中，该抗体抑制CTLA-4和B7-1之间结合的IC50为大约10nM或更低，更优选约5nM或更低，最优选约1nM。
可供替代地，该抗体与具有选自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争结合。例如，该抗体能够与具有选自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体之结合表位相结合。
在另一个实施方案中，本发明使用的抗体包含了含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重链，和含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的轻链，或由所述CDR序列发生了序列改变，这种改变选自保守性改变，其中所述保守性改变选自非极性残基被其它非极性残基置换、极性不带电荷残基被其它极性不带电荷残基置换、极性带电荷残基被其它极性带电荷残基置换、和结构相似残基的置换；非保守性替代，其中所述非保守性替代选自极性带电荷残基替代极性不带电荷残基和非极性残基替代极性残基；添加；和缺失。在本发明的一个进一步实施方案中，抗体在构架区或CDR区中与种系(germline)序列相比含有少于10、7、5或3个氨基酸的改变。在另一个实施方案中，抗体在构架区中含有少于5个氨基酸的改变，在CDR区含有少于10个氨基酸的改变。在一个优选实施方案中，抗体在构架区含有少于3个氨基酸的改变，在CDR区中含有少于7个氨基酸改变。在一个优选实施方案中，构架区中的改变是保守性改变，CDR区中的改变是体细胞突变。
在一个优选实施方案中，该抗体包含了含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重链，和含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的轻链。在另一个实施方案中，该抗体与选自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、和12.9.1.1的抗体具有相同的重链和轻链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，该抗体含有人3-33基因的重链氨基酸序列和人A27或O12基因的轻链序列。
本发明也涉及一种治疗哺乳动物癌症的药物组合物，其包含有效治疗所述癌症量的人抗CTLA-4抗体和药学上可接受载体，其中所述癌选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统癌、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括那些由石棉诱导的癌症，以及所述癌的组合。在一个实施方案中，本方法涉及联合药物组合物，其还包含与所述抗体联合能有效治疗癌症量的化学治疗剂、癌疫苗、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗血管剂、信号转导抑制剂、抗增生剂、调亡诱导物和存活途径抑制剂。
本发明还涉及有效治疗哺乳动物癌症量的人抗CTLA-4抗体在制备用于治疗哺乳动物癌症的组合物中的应用，其中所述癌选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括那些由石棉诱导的癌症，以及所述癌的组合。
附图简述

图1显示抗CTLA-4抗体4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的全长核苷酸和氨基酸序列。
图2显示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的预测的重链与种系DP-50(3-33)氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示。
图3显示克隆2.1.3的预测的重链序列与种系DP-65(4-31)氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示，CDRs用下划线标出。
图4显示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2和4.13.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A27氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示，CDRs用下划线标出。
图5显示克隆3.1.1、11.2.1、11.6.1和11.7.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系O12氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示，CDRs用下划线标出。
图6显示克隆2.1.3的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A10/A26氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示，CDRs用下划线标出。
图7显示克隆12.3.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A17氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示，CDRs用下划线标出。
图8显示克隆12.9.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A3/A19氨基酸序列之间的氨基酸序列比对。由种系发生的改变用粗体表示，CDRs用下划线标出。
发明详述这里引用的所有专利、专利申请、出版物和其它参考文献以其完整形式引入作为参考。
抗血管生成剂，例如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂，可以与抗体联合用于本发明的方法中。有用的COX-II抑制剂的例子包括CELEBREXTM(celecoxib)、valdecoxib、rofecoxib。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的例子在WO96/33172(1996年10月24日公开)、WO96/27583(1996年3月7日公开)、欧洲专利申请97304971.1(1997年7月8日申请)、欧洲专利申请99308617.2(1999年10月29日申请)、WO98/07697(1998年2月26日公开)、WO98/03516(1998年1月29日公开)、WO98/34918(1998年8月13日公开)、WO98/34915(1998年8月13日公开)、WO98/33768(1998年8月6日公开)、WO98/30566(1998年7月16日公开)、欧洲专利出版物606046(1994年7月13日公开)、欧洲专利出版物931788(1999年7月28日公开)、WO90/05719(1990年5月31日公开)、WO99/52910(1999年10月21日公开)、WO99/52889(1999年10月21日公开)、WO99/29667(1999年6月17日公开)、PCT国际申请PCT/IB98/01113(1998年7月21日申请)、欧洲专利申请99302232.1(1999年3月25日申请)、英国专利申请9912961.1(1999年6月3日申请)、美国临时申请60/148,464(1999年8月12日申请)、美国专利5,863,949(1999年1月26日出版)、美国专利5,861,510(1999年1月19日出版)和欧洲专利出版物780386(1997年6月25日公开)中有描述。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是抑制MMP-1的活性很低或不抑制其活性的那些。更优选的是相对于其它基质金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)来说，选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
一些本发明中有用的具体MMP抑制剂例子是AG-3340、RO 32-3555、RS13-0830和下列化合物3-[[4-(4-氟苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟氨基甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基胺；(2R，3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基胺；4-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢吡喃-4-羧酸羟基胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟氨基甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸；4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢吡喃-4-羧酸羟基胺；(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢吡喃-3-羧酸羟基胺；(2R，3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-苄氧基)-苯磺酰基]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基胺；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(1-羟氨基甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸；3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰基]-(4-羟氨基甲酰基-四氢吡喃-4-基)-氨基]-丙酸；3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基胺；3-内-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基胺；和(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢呋喃-3-羧酸羟基胺；和所述化合物的药学上可接受盐和溶剂合物。
其它抗血管生成剂，包括其它COX-II抑制剂和其它MMP抑制剂，也能用于本发明。
抗体也可以与以下物质共同给药有丝分裂抑制剂，如长春碱；烷化剂，如顺铂，卡铂和环磷酰胺；抗代谢物，如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷和羟基脲，或，如欧洲专利申请239362中公开的优选抗代谢物之一，如N-(5-[N-3，4-二氢-2-甲基-4-氧代喹唑啉-6-基甲基)-N-甲基氨基]-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸；生长因子抑制剂；细胞周期抑制剂；嵌入抗生素，如多柔比星和博来霉素；酶，如干扰素；和抗激素，如抗雌激素，比如NolvadexTM(他莫昔芬)或，如抗雄激素，比如CasodexTM(4’-氰基-3-(4-氟苯磺酰)-2-羟基-2-甲基-3’-(三氟甲基)N-丙酰苯胺)。
这里描述的结合(联合)治疗可以通过将各治疗成分同时、顺序或间隔给药的方式来实现。
抗体也可以与信号转导抑制剂共同使用，例如能抑制EGFR(表皮生长因子受体)反应的试剂，如EGFR抗体、EGF抗体和属于EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如VEGF受体和能抑制VEGF的分子；和erbB2受体抑制剂，如与erbB2受体结合的有机分子或抗体，例如Herceptin(加利福尼亚South San Fransisco的Genentech公司)。
EGFR抑制剂在如WO95/19970(1995年7月27日公开)、WO98/14451(1998年4月9日公开)、WO98/02434(1998年1月22日公开)和美国专利5,747,498(1998年5月5日颁发)中有描述，这里所描述的这类物质可用于本发明。EGFR抑制剂包括但不限于，单克隆抗体C225、抗EGFR 22Mab(纽约Imclone Systems公司，纽约)，和ABX-EGF(Abgenix Inc.Of Fremont，加利福尼亚)，化合物ZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingelheim)、MDX-447(Medarex Inc.OfAnnandale，新泽西州)和OLX-103(Merck & Co.Of Whitehouse Station，新泽西州)、VRCTC-310(Ventech Research)和EGF融合毒素(SeragenInc.Of Hopkinton，Massachusettes)。这些以及其它EGFR抑制剂可用于本发明。
VEGF抑制剂，如SU-5416和SU-6668(Sugen公司，South SanFrancisco，加利福尼亚)，也可以与抗体联合使用。VEGF抑制剂在如WO99/24440(1999年5月20日公开)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(1999年5月3日申请)、WO95/21613(1995年8月17日公开)、WO96/61422(1999年12月2日公开)、美国专利5,834,504(1998年11月10颁发)、WO98/50356(1998年11月12日公开)、美国专利5,883,113(1999年3月16日颁发)、美国专利5,886,020(1999年3月23日颁发)、美国专利5,792,783(1998年8月11日颁发)、WO99/10349(1999年3月4日公开)、WO97/32856(1997年9月12日公开)、WO97/22596(1997年6月26日公开)、WO98/54093(1998年12月3日公开)、WO98/02438(1998年1月22日公开)、WO99/16755(1999年4月8日公开)和WO98/02437(1998年1月22日公开)中有描述。其它一些具体的可用于本发明的VEGF抑制剂的例子是IM862(Cytran Inc.Of Kirkland，华盛顿)；IMC-1C11 Imclone抗体、加利福尼亚州South San Francisco的Genentech公司的抗VEGF单克隆抗体和angiozyme-一种由核酶(Boulder，科罗拉多州)和Chiron(Emeryville，加利福尼亚)合成的核酶。
ErbB2受体抑制剂，如GW-282974(Glaxo Wellcome plc)和单克隆抗体AR-209(Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands，得克萨斯)和2B-1(chiron)，可以进一步与抗体联合，例如在WO98/02434(1998年1月22日公开)、WO99/35146(1999年7月15日公开)、WO99/35132(1999年7月15日公开)、WO98/02437(1998年1月22日公开)、WO97/13760(1997年4月17日公开)、WO95/19970(1995年7月27日公开)、美国专利5,587,458(1996年12月24日出版)和美国专利5,877,305(1999年3月2日出版)中指出的。本发明中有用的ErbB2受体抑制剂在EP1029853(2000年8月23日公开)和WO00/44728(2000年8月3日公开)中也有描述。在前述PCT申请、美国专利和美国临时申请中描述的ErbB2受体抑制剂化合物和物质，以及其它抑制ErbB2受体的化合物和物质可以与根据本发明的抗体合用。
抗体也可以与治疗异常细胞生长或癌症有效的其它试剂合用，这些试剂包括但不限于其它能够增强抗肿瘤免疫反应的试剂，如另外的、不同的、CTLA4抗体和也能够阻断CTLA4的其它试剂；以及抗增生剂如法尼基蛋白转移酶抑制剂和αvβ3抑制剂，如αvβ3抗体Vitaxin，αvβ5抑制剂、p53抑制剂等。
当抗体联合另一种免疫调节剂给药时，免疫调节剂可以选自例如树突细胞活化剂如CD40配体和抗CD40激动剂抗体，以及抗原呈递增强剂、T细胞趋化增强剂、肿瘤相关免疫抑制因子抑制剂，如TGF-β(转化生长因子β)，和IL-10。
抗体也可以和其它通过结合IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)抑制肿瘤生长的抗体或配体联合给药。可用于本发明的具体的抗IGF-1R抗体包括在2001年12月20日申请的PCT申请PCT/US01/51113中描述的那些抗体。
抗体也可与细胞因子联合给药，如IL-2、IFN-g、GM-CSF、IL-12、IL-18和FLT-3L。
除了含有癌症相关抗原的癌疫苗外，可有效联合抗体的疫苗包括但不限于GM-CSF DNA和细胞为基础的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒(例如痘苗病毒)疫苗和热休克蛋白(HSP)疫苗。有效的疫苗还包括肿瘤疫苗，如黑素瘤细胞制成的疫苗，而且可以是自身的或同种异体的。该疫苗可以是如基于肽、DNA或细胞的疫苗。
抗体可以与抗激素治疗剂共同给予，如抗雌激素或抗雄激素治疗剂，或选择性雌激素受体调节剂(SERMs)。
在另一个实施方案中，该抗体可以给免疫抑制的患者施用，如化疗、透析、外科手术，或由年龄相关的免疫病变造成的免疫抑制。抗体可用于协助免疫受抑群体对疫苗的免疫反应。
抗体也可用于协助治疗或预防传染性疾病，包括细菌、寄生虫或病毒性疾病。如果需要，抗体可联合抗感染疫苗共同给予。
本发明的方法可以是新辅助治疗/辅助治疗，用于缓解这里提及的疾病有关的症状和异常细胞生长有关的症状。此类治疗可以是单独治疗或联合化疗和/或免疫疗法和/或疫苗治疗。
给予低剂量或高剂量放射治疗的技术是本领域中已知的，这些技术可用于这里所述的联合治疗。
用抗体治疗能够使异常细胞对放射治疗更敏感，达到杀死和/或抑制这种细胞生长的目的。因此，本发明进一步涉及一种使哺乳动物异常细胞对射线敏感的方法，包括给哺乳动物施予有效使异常细胞对放射治疗敏感的量的抗CTLA4抗体。
抗体可用来治疗或预防初发疾病，或治疗或预防复发。它可用来治疗早期或晚期疾病。在一个实施方案中，用该抗体预防遗传性肿瘤。它也可用于预防由于感染HVP(人乳头状瘤病毒)、EBV(EB病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒)、丙型肝炎的高危人群发生肿瘤，或治疗与这些感染有关的肿瘤。该抗体也可用于降低术后肿瘤生长的风险，或与接触毒素有关的肿瘤生长的风险。
这里所用的术语“治疗(treating)”，除非另外说明，是指逆转、缓解、抑制进展，或预防该术语应用的障碍或疾病，或这种障碍或疾病的一种或多种症状。这里所用的术语“治疗(treatment)”，除非另外说明，涉及上面定义的“治疗”的治疗行为。
术语“表位”包括任何能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异结合的蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或糖基侧链，并且通常具有特定三维结构特征，和特定电荷特性。当解离常数小于等于1μM时，优选小于等于100nM，最优选小于等于10nM时，称抗体与抗原特异性结合。
本发明可使用的抗体的制备方法在PCT公开申请WO00/37504(2000年6月29日公开)中有描述。
术语“人抗体”是指一种抗体，它具有来自人基因的氨基酸序列，人基因包括转基因小鼠或别处中的人基因，并包括由人基因产生抗体序列时发生的体细胞突变或其它改变得到的序列。本发明包括下述氨基酸序列的改变类型。
因而，由这里举例的具体抗体发生氨基酸序列改变而来的抗体也可用于本发明的方法。例如，序列具有“实质等同性”是指在最佳比对时，比如执行采用缺省空位加重的GAP程序或BESTFIT，原始序列和改变后序列在完整抗体、可变区、构架区或CDR区中具有至少80％的序列等同性，优选至少90％的序列等同性，更优选至少95％的序列等同性，最优选至少99％的序列等同性。优选不同的残基位点的差异是由保守氨基酸替代而造成的。保守氨基酸替代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含氨基侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。例如，合理的期望是用异亮氨酸或缬氨酸单独置换亮氨酸，用谷氨酸置换天冬氨酸，用丝氨酸置换苏氨酸，或类似的用结构相关的氨基酸进行替代，替代后对所得分子的结合或特性不产生大的影响，特别是当不对构架区位点中的氨基酸进行置换时。氨基酸改变是否产生功能肽可以很容易地通过估计多肽衍生物的比活性来确定。
本领域普通技术人员可以很容易制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。优选在功能区的边界附近产生片段或类似物的氨基或羧基末端。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公众或私有序列数据库进行比较来鉴别结构和功能区。优选地，用计算机化的比较方法鉴别结构和/或功能已知的其它蛋白质存在的序列基序或预测的蛋白构象域。鉴别折叠为已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等，Science253164(1991)。因此，前述例子证明根据本发明本领域技术人员能够识别可以用于确定结构和功能区的序列基序和结构构象。
优选的氨基酸替代是(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低氧化易感性，(3)改变形成蛋白复合体的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或修饰这些类似物的其它物理化学特性或功能特性的那些替代。类似物可以包括有天然存在的肽序列以外序列的多种突变蛋白质。例如，单个或多个氨基酸替代(优选保守氨基酸替代)可以在天然发生的序列(优选在形成分子间联系的区域之外的多肽部分)中制得。一个保守的氨基酸替代不应该从本质上改变亲本序列的结构特性(如，一个替代氨基酸不应趋于破坏亲本序列中的螺旋，或打破标志亲本序列特征二级结构其它类型)。本领域已知的多肽二级结构和三级结构的例子在Proteins，Structures and Molecular Principles(Creithton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984)；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991)；和Thornton等，Nature354105(1991)中有描述。
这里使用的术语“抗体”涉及完整的抗体，或其结合片段，该片段能与该完整抗体特异性结合发生竞争。结合片段由重组DNA技术产生，或用酶或化学切割完整抗体产生。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。一种抗体，除了“双特异性”或“双功能”抗体外，应理解为其结合位点相同。当过量抗体降低结合反受体的受体量达到至少约20％、40％、60％或80％，甚至常常更大于约85％(用体外竞争结合试验测定)时，该抗体实质上抑制受体与反受体的粘附。
本发明使用的抗体能被加入到适合给被试者施用的药物组合物中。典型地，该药物组合物包括抗体和药学上可接受的载体。这里使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受载体的例子包括一种或多种水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其联合物。在许多情况下，优选组合物中包括等渗剂，如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受物质如润湿剂或少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲液，它们能够延长该抗体或抗体部分的保存期限或有效性。
该抗体可以以多种形式存在。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体制剂形式，如液体溶液(如可注射和灌注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式依赖于预期给药方式和治疗应用。典型的优选组合物是可注射或灌注溶液形式，如与其它抗体给人被动免疫时使用的组合物相似的组合物。优选的给药方式是非肠胃途径(如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个优选实施方案中，该抗体通过静脉内灌注或注射给予。在另一个优选实施方案中，该抗体通过肌内或皮下注射给予。
药物组合物典型地应该是无菌的，并且在制备和贮存条件下保持稳定。该组合物能被配制为溶液、微乳、分散体、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。无菌注射溶液可通过将需要量的该抗体加入到一种适当溶剂中来制备，其中含有上述列举成分之一或其组合(如果需要)，之后进行过滤灭菌。一般来说，分散体可通过将活性化合物加入到一种无菌载体中来制备，该载体中含有一种基本分散介质以及上述列举的其它所需成分。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干，由其前述的无菌过滤溶液产生一种粉末，其中含有活性成分加任何另外的期望成分。溶液的适当流动性能够这样保持，例如，通过使用包衣剂如卵磷脂，对于分散体，通过维持所需微粒大小，和通过使用表面活性剂。在组合物中加入延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，能延长注射组合物的吸收。
该抗体能以多种本领域已知的方法给予，包括但不限于，口服、非肠胃、粘膜、吸入、局部、口腔、经鼻和直肠。对于许多治疗应用，优选的给药途径/方式是皮下、肌内、静脉内或灌注。如果希望，可采用无针注射。如熟练技术人员期望的，给药途径/方式会随着期望的结果而改变。
在某些实施方案中，该抗体可以和保护该化合物不被快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物、经皮膜片和微囊化传递系统。可以使用可生物降解的生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。很多制备这种制剂的方法已经被授权或是本领域技术人员通常都知道的。见，如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在一些实施方案中，该抗体可以口服给予，如在一种惰性稀释液中或一种可同化食用载体中。该抗体(如果需要，连同其它成分)也可以装入硬或软明胶胶囊中，压制成片剂或直接加入到患者的饮食中。对于口服治疗给药，该抗体可被加入赋形剂并用于制成吞服片、口含片、糖锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等。不同于非肠道途径的抗体给予方法，可能需要用一种防止其失活的材料包衣，或将该化合物与这种材料共同给予。
可以调整剂量方案，提供期望的最佳反应(如治疗或预防反应)。例如，可以给予单一大丸剂(bolus)，随时间推移给予几个分离的剂量，或剂量也可以根据治疗情况紧急性成比例地减量或加量。配制剂量单位形式的非肠道组合物特别有好处，易于给药和统一剂量。这里使用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，适宜于作为单一剂量给予待治疗的哺乳动物被试者；每一单位含有在联合需要的药学载体时，产生期望的治疗效果而计算的预定量活性化合物。本发明剂量单位形式的规格通过(a)抗体的独特特性和要达到的具体的治疗或预防效果，和(b)组合这种活性化合物用于治疗个体敏感性的领域固有的限制来确定，并且直接依赖于它。
一个根据本发明给予的治疗或预防的抗体有效量的示例但无限制性的范围是0.1-100mg/kg，更优选0.5-50mg/kg，再优选1-20mg/kg，甚至更优选1-10mg/kg。应该注意的是剂量值可以随待缓解病情的类型和严重性而改变。应进一步理解的是，对于任何特定的被试者，应根据个体需要和给予或监测给予此组合物的人的专业判断，随时调整特定的剂量方案，而且这里列出的剂量范围只是实例，并不企图限制权利要求的组合物的范围或实施。
在一个实施方案中，以静脉内配制品给予该抗体，它是含5或10mg/ml抗体的无菌水溶液，还有20mM醋酸钠、0.2mg/ml聚山梨醇酯80和140mM的氯化钠，pH 5.5。
在一个实施方案中，部分剂量通过静脉内大丸剂给予，剩余的通过灌注抗体配制品给予。而在另一个实施方案中，0.01mg/kg抗体静脉内大丸剂注射，接着在3-5分钟内0.1mg/kg静脉内注射，然后灌注含1到3mg/kg的100ml盐水，100ml/小时，再灌注含4到10mg/kg的250ml盐水，100ml/小时，灌注含12.5到21mg/kg的500ml盐水，100ml/小时，灌注含28mg/kg的600ml盐水(500+100袋子)，120ml/小时。
本发明方法中使用的抗体可以被标记。这可以通过掺入一个可检测标记来完成，如掺入放射性标记的氨基酸或给多肽连上可被标记的抗生物素蛋白(如带有荧光标记或酶活性的链霉抗生物素，可被光学或比色方法检测到)检测到的生物素化部分。在特定情况下，该标签或标记也可以是治疗性的。本领域已知并可以使用多种标记多肽和糖蛋白的方法。标记多肽的例子包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素(如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(如FITC、罗丹明、镧系无机发光材料)、酶学标记(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光剂、生物素化基团、第二报告分子识别的预定多肽表位(如亮氨酸拉链对序列、二抗结合位点、金属结合区、表位标记)。在一些实施方案中，标记连上各种长度的间隔臂，以降低潜在的空间位阻。
已知抗体基本结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对等同多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括一个约100到110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链羧基末端部分限定一个恒定区，主要起效应子功能。人轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并限定抗体的同种型，分别是IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区由一个约12或更多氨基酸的“J”区连接，重链也包括一个约10或更多个氨基酸的“D”区。一般可见于Fundamental ImmunologyCh 7(Paul，W.，ed.，2nded.Raven Press，N.Y.(1989))。每对轻/重链的可变区构成抗体结合位点。
因而，一个完整的IgG抗体具有两个结合位点。除了双功能或双特异性的抗体，这两个结合位点是相同的。这些链均呈现相同的相对保守的构架区(FR)的一般结构，该构架区由三个高变区，也叫互补决定区或CDRs，连接而成。来自每对两条链的CDRs经构架区连成一行，使得能够结合特异表位。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDE3和FR4区。每个区的氨基酸指定均依照Kabat的Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991)，或Chothia &Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等.Nature342878-883(1989)的定义。
本发明中使用的抗体优选来自表达人免疫球蛋白基因的细胞。本领域已知使用转基因小鼠来产生这种“人”抗体。这种方法之一在Mendez等.Nature Geneties 15146-156(1997)，Green and Jakobovits J.Exp.Med.188483-495(1998)和美国专利申请系列08/759,620(1996年12月3日申请)有描述。使用这种小鼠获得人抗体也在美国专利申请07/466,008(1990年1月12日申请)、07/610,515(1990年11月8日申请)、07/919,297(1992年7月24日申请)、07/922,649(1992年7月30日申请)、08/031,801(1993年3月15日申请)、08/112,848(1993年8月27日申请)、08/234,145(1994年4月28日申请)、08/376,279(1995年1月20日申请)、08/430,938(1995年4月27日申请)、08/464,584(1995年6月5日申请)、08/464,582(1995年6月5日申请)、08/463,191(1995年6月5日申请)、08/462,837(1995年6月5日申请)、08/486,853(1995年6月5日中请)、08/486,857(1995年6月5日申请)、08/486,859(1995年6月5日申请)、08/462,513(1995年6月5日申请)、08/724,752(1996年10月2日申请)和08/759,620(19965年12月3日申请)中有描述。也可见Mendez等.Nature Genetics 15146-156(1997)和Greenand Jakobobits J.Exp.Med.188483-495(1998)。也见欧洲专利EP0463151(批准
公开日1996年6月12日)、国际专利申请WO94/02602(1994年2月3日公开)、国际专利申请WO96/34096(1996年10月31日公开)和WO98/24893(1998年6月11日公开)。
一种制备产生人抗体的转基因小鼠的可替代方法是“小座位”(minilocus)方法，其中通过包含Ig的片段(单个基因)来模拟外源Ig座位。一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成一个导入动物的构建体。见Surani等的美国专利5,545,807，以及Lonberg和Kay的美国专利5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650和5,814,318，Krimepenfort和Berns的美国专利5,591,669，Berns等的美国专利5,612,205、5,721,367、5,789,215，以及Choi和Dunn的美国专利5,643,763，和GenPharm International的美国专利申请07/574,748(1990年8月29日申请)，07/575,962(1990年8月31日申请)，07/810,279(1991年12月17日申请)，07/853,408(1992年3月18日申请)，07/904,068(1992年6月23日申请)，07/990,860(1992年12月16日申请)，08/053,131(1993年4月26日申请)，08/096,762(1993年7月22日申请)，08/155,301(1993年11月18日申请)，08/161,739(1993年12月3日申请)，08/165,699(1993年12月10日申请)，08/209,741(1994年3月9日申请)。也见欧洲专利546073B1，国际专利申请WO92/03918、WO92/222645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852和WO98/24884。
在另一个方案中，本发明方法中使用的抗体不完全是人的，而是“人源化的”。尤其是，使用本领域熟知的技术可将鼠抗体或其它物种抗体人源化或灵长类源化。见如Winter和Harris Immunol Today1443-46(1993)和Wright等Crit.Reviews In Immunol.12125-168(1992)。用重组DNA技术改造抗体，用相应的人序列置换CH1、CH2、CH3、铰链区和/或构架区(见WO92/02190和美国专利5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350和5,777,085)。此外，使用Ig cDNA构建嵌合免疫球蛋白基因是本领域已知的(Liu等.P.M.A.S.843439(1987)和J.Immunol.1393521(1987))。从杂交瘤或其它产生抗体的细胞分离mRNA并用于产生cDNA。可以采用特异性引物利用聚合酶链式反应扩增感兴趣的cDNA(美国专利4,683,195和4,683,202)。可替换地，构建文库并筛选分离感兴趣的基因。接着将编码抗体可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。人恒定区基因序列可在kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，N.I.H.publication NO.91-3242中找到。人C区基因很容易由已知克隆得到。同型选择将由期望的效应子功能来指导，如补体固定或抗体依赖性细胞毒性活性。优选的同型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。特别优选本发明抗体的同型是IgG2和IgG4。可以使用或κ或λ的人轻链恒定区。接着常规方法表达嵌合的人源化的抗体。
正如上指出的，本发明包括抗体片段(包括在这里定义的“抗体”中)的应用。抗体片段，如Fv、F(ab’)2和Fab可将完整蛋白切割而制备，如用蛋白酶或化学切割。可替换地，设计截短基因。例如，编码一部分F(ab’)2片段的嵌合基因将包括编码CH1区和H链铰链区，及其后的翻译终止密码子的DNA序列以产生截短分子。
在一个方法中，使用编码重链和轻链J区的共有序列设计寡核苷酸用作引物，将有用的限制性酶切位点引入J区，用于随后将V区片段连接到人C区片段。可通过定点诱变修饰C区cDNA，将限制性酶切位点放在人序列的类似位置。
本发明所用的获得抗体时使用的表达载体包括质粒、逆转录病毒、粘粒载体、YACs、来自EBV的附加体等。一种方便的载体通常是编码一个功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，并带有改造的合适的限制性酶切位点，以使任何VH或VL序列都可以容易地被插入和表达的载体。在这种载体中，剪接通常发生在被插入的J区中的剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，并且也可发生在人CH外显子内发生的剪接区。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。所得嵌合抗体可与任何强启动子连接，包括逆转录病毒LTRs，如SV-40早期启动子，(Okayama等Mol.Cell.Bio.3280(1983))，劳斯肉瘤病毒LTR(Gorman等.P.N.A.S.796777(1982))和莫洛尼鼠类白血病毒LTR(Grosschedl等.Cell 41885(1985))；天然Ig启动子等。
对实施本发明有用的人抗体或来自其它物种的抗体也可通过展示型技术产生，包括但不限于，噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它本领域中熟知的技术。可对所得分子进行另外的成熟，如亲和成熟，如本领域熟知的这种技术。Wright和Harris，Immunol Today1443-46(1993)，Hanes和Plucthau，PNAS USA 944937-4942(1997)(核糖体展示)，Parmley和Smith，Gene 73305-318(1988)(噬菌体展示)，Scott TIBS 17241-245(1992)，Cwirla等.PNAS USA 876378-6382(1990)，Russel等.Nucl.Acids Research 211081-1085(1993)，Hoganboom等.Immunol.Reviews 13043-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH 1080-84(1992)和美国专利5,733,743。如果用展示技术产生非人类的抗体，这种抗体可如上所述进行人源化。
利用这些技术，抗体可由CTLA-4表达细胞、CTLA-4本身、CTLA-4的各种形式、其表位或肽，以及其表达文库(如见美国专利5,703,057)而产生，该文库其后可用来筛选上述活性。
产生的用于本发明的抗体起始不需要有特定的期望同型。相反，产生的抗体可具有任何同型并可随后利用常规技术进行同型转换。这些包括定向重组技术(如见美国专利4,816,397)和细胞融合技术(如见美国专利申请08/730,639(1996年10月11日申请))。
如上指出，为了多种治疗应用，本发明抗体的效应子功能可以通过同型转换为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM而发生改变。而且，可通过使用双特异性物质、免疫毒素或放射性标记等来避免依赖于补体杀灭细胞。
能够产生双特异性抗体，其包含(i)两个抗体一个的特异性针对CTLA-4，另一个的特异性针对第二分子，(ii)单个抗体，其一条链特异性针对CTLA-4，第二条链特异性针对第二分子，或(iii)特异性针对CTLA-4和第二种分子的单链抗体。可以使用熟知技术产生这种双特异性抗体，如Fanger等.Immunol Methods 472-81(1994)，Wright andHarris，如上所述，和Traunecker等.Int.J.Cancer(Suppl.)751-52(1992)。
用于本发明的抗体也包括可以制备的“kappabodies”(III等.“Design and construction of a hybrid Immunoglobulin domain withproperties of both heavy and light chain variable regions”ProteinEng 10949-57(1997))，“minibodies”(Martin等.“Theaffinity-selection of a minibody polypeptide Inhibitor of humanInterleukin-6”EMBO J135303-9(1994))，“diabodies”(Holliger等.“Diabodiessmall bivalent and bispecific antibody fragments”PNAS USA 906444-6448(1993))，和“janusins”(Traunecker等.“Bispecific single chain molecules(janusins)target cytotoxiclymphocytes on HIV Infected cells”EMBO J 103655-3659(1991)和Traunecker等.“Janusinnew molecular design for bispecificreagents”Int J Cancer Suppl 751-52(1992))。
可以用常规技术对使用的抗体进行修饰用作免疫毒素。如见VitettaImmunol Today 14252(1993)。也可见美国专利5,194,594。放射性标记抗体也能用熟知技术来制备。如见Junghans等.Cancer Chemotherapyand Biotherapy 655-686(第二版，Chafner和Longo编，LippincottRaven(1996))。也见美国专利4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE35,500)、5,684,471和5,697,902。
用于实施本发明的具体抗体包括在WO 00/37504中描述和指明为3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体。尽管这里提供了这些序列的信息，在WO 00/37504中可得到更进一步的信息。这些抗体是完全人的IgG2或带有人κ轻链的IgG4重链。本发明特别涉及具有这些抗体的氨基酸序列的抗体的应用。本发明还涉及具有这些抗体的重链和轻链CDRs的氨基酸序列的抗体，以及如上所述的在CDR区发生改变的抗体。
本发明中使用的抗体优选具有很高亲和力，当用固相法或溶液法测定时，典型的Kds从大约10-9到大约10-11M。
用于本发明的抗体可在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的序列能用于转化合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的将多核苷酸导入一种宿主细胞的方法，例如将多核苷酸包装到病毒(或包装到病毒载体)中，并用该病毒(或载体)转导宿主细胞，或用本领域已知的转染步骤，如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455中举例说明的。将异种多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法是本领域中熟知的，包括但不限于，葡聚糖介导转染、磷酸钙沉淀、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导转染、脂质体融合、电穿孔、微粒轰击、多核苷酸包装到脂质体、肽接合物、dendrimers、和将DNA直接显微注射到核中。
可用作表达用宿主细胞的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，包括许多从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO0、HeLa细胞、仓鼠胎肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞和人肝细胞癌细胞(如Hep G2)。也可使用非哺乳动物细胞，包括细菌、酵母、昆虫和植物细胞。为了防止由于非人糖基化造成的免疫原性、药物代谢动力学和/或效应子功能的改变，优选定点诱变抗体CH2区除去糖基化。谷氨酰胺合成酶的表达在欧洲专利216846、256055和323997以及欧洲专利申请89303964.4中有完整或部分讨论。
用在本发明中的抗体也可以通过制得目的免疫球蛋白重链和轻链序列转基因的哺乳动物或植物，并从中得到可回收形式的抗体，由转基因产生。转基因抗体可以从山羊、牛或其它哺乳动物的乳汁中产生并回收。如见美国专利5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
图1显示了下列抗CTLA-4抗体的全长核苷酸和氨基酸序列4.1.1全长4.1.1重链(cDNA 22(a)，基因组22(b)，和氨基酸22(c))；全长去糖基化(aglycosylated)4.1.1重链(cDNA 22(d)和氨基酸22(e))；4.1.1轻链(cDNA 22(f)和氨基酸22(g))；4.8.1全长4.8.1重链(cDNA 22(h)和氨基酸22(i))；4.8.1轻链(cDNA 22(j)和氨基酸22(k))；6.1.1全长6.1.1重链(cDNA 22(l)和氨基酸22(m))；6.1.1轻链(cDNA 22(n)和氨基酸22(o))；11.2.1全长11.2.1重链(cDNA 22(p)和氨基酸22(q))；和11.2.1轻链(cDNA 22(r)和氨基酸22(s))。
信号肽序列以粗体和大号字显示。全长4.1.1基因组DNA序列中的开放阅读框架(图1(b))被加有下划线。导入突变使4.1.1重链去糖基化以及发生的改变(N29Q)以双下划线和粗体字文本显示(cDNA图1(b)和氨基酸图1(c))。
图2显示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、3.1.1、4.10.2、4.13.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的预测的重链氨基酸序列与种系DP-50(3-33)氨基酸序列之间的序列比对。种系DP-50序列与这些克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置。CDR1和CDR2序列的位置在所示表的边缘用箭头标出。CDR3的氨基末端也在边缘示出，但是羧基末端是可变的，在序列N末端附近的氨基酸结束。
图3显示克隆2.1.3的预测的重链氨基酸序列与种系DP-65(4-31)氨基酸序列之间的序列比较。种系DP-65种系序列与该克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了该抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下划线标出。
图4显示克隆4.1.1、4.8.1、4.14.3、6.1.1、4.10.2和4.13.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A27氨基酸序列之间的序列比较。种系A27序列与这些克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了该抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下划线标出。在克隆4.8.1、4.14.3和6.1.1的CDR1s的明显缺失用“Os”表示。
图5显示克隆3.1.1、11.2.1、11.6.1和11.7.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系O12氨基酸序列之间的序列比较。种系O12序列与这些克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下划线标出。
图6显示克隆2.1.3的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A10/A26氨基酸序列之间的序列比较。种系A10/A26序列与这些克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下划线标出。
图7显示克隆12.3.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A17氨基酸序列之间的序列比较。种系A17序列与这些克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下划线标出。
图8显示克隆12.9.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A3/A19氨基酸序列之间的氨基酸序列比较。种系A3/A19序列与该克隆的序列之间的差异用粗体表示。该图也显示了抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列的位置，用下划线标出。
下表显示了本发明抗体的H和L链FR和CDR区从种系发生氨基酸改变的个数
序列表序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.<120>抗CTLA-4抗体的应用<130>PC23019A<140><141><150>60/293042<151>2001-05-23<160>39<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>1392<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120tgtgtagcgt ctggattcac cttcagtagc catggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagaaataa atactatgca 240gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtttctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggtcac 360ttcggtcctt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 420aagggcccat cggtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcg 480gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540ggcgctctga ccagcggcgt gcacaccttc ccagctgtcc tacagtcctc aggactctac 600tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcaacttcg gcacccagac ctacacctgc 660aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga cagttgagcg 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权利要求
1.一种治疗哺乳动物癌症的方法，包括给所述哺乳动物施用能有效治疗所述癌症量的人抗CTLA-4抗体，其中所述癌选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤和所述癌的组合。
2.权利要求1的方法，包括将所述抗体与选自下组的药剂联合施用给所述哺乳动物化学治疗剂、癌疫苗、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗血管剂、信号转导抑制剂、抗增生剂、调亡诱导物和存活途径抑制剂。
3.权利要求1的方法，包括将所述抗体与抗血管生成剂联合施用，其中所述的抗血管生成剂选自MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂。
4.权利要求1的方法，包括将所述抗体与化学治疗剂联合施用，其中所述的化学治疗剂选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节物、抗激素、血管生成抑制剂和抗雄激素。
5.权利要求1的方法，包括将所述抗体与信号转导抑制剂联合施用，其中所述的信号转导抑制剂选自EGFR(表皮生长因子受体)抑制剂、VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂和erbB2受体抑制剂。
6.权利要求1的方法，包括将一定量的所述抗体与放射疗法联合处理哺乳动物，其中联合放射疗法的抗体的量能有效抑制哺乳动物的异常细胞生长或治疗过度增生性疾病。
7.权利要求1的方法，其中与CTLA-4结合的抗体具有下列特性与CTLA-4的结合亲和力为大约10-9或更高；抑制CTLA-4和B7-1之间结合的IC50为大约100nM或更低；和抑制CTLA-4和B7-2之间结合的IC50为大约100nM或更低；并含有包含了人FR1、FR2和FR3氨基酸序列的重链氨基酸序列，该人FR1、FR2和FR3氨基酸序列对应于VH3-33基因的那些，或其中发生了保守替代或体细胞突变，其中FR序列与CDR1、CDR2和CDR3序列相连，且其中所述抗体在轻链中也包含来自A27或O12基因的CDR区。
8.权利要求7的方法，其中所述的FR1、FR2或FR3序列由VH3-33基因发生体细胞突变产生。
9.权利要求1的方法，其中所述抗体与具有选自4.1.1、4.8.1、6.1.1和11.2.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争结合CTLA-4。
10.权利要求1的方法，其中所述的抗体包含了含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.l3.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重链，和含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的轻链，或由所述CDR序列发生了序列改变，这种改变选自保守性改变，其中所述保守性改变选自非极性残基被其它非极性残基置换、极性不带电荷残基被其它极性不带电荷残基置换、极性带电荷残基被其它极性带电荷残基置换、和结构相似残基的置换；非保守性替代，其中所述非保守性替代选自极性带电荷残基替代极性不带电荷残基和非极性残基替代极性残基；添加；和缺失。
11.权利要求10的方法，其中所述抗体包含了含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的重链，和含有选自3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的抗体的CDR-1、CDR-2和CDR-3氨基酸序列的轻链。
12.权利要求1的方法，其中所述抗体选自含有人3-33基因的重链氨基酸序列和人A27或O12基因的轻链氨基酸序列的抗体。
13.一种用于治疗哺乳动物癌症的药物组合物，其包含能有效治疗所述癌症量的人抗CTLA-4抗体和药学上可接受的载体，其中所述癌选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤，以及所述癌的组合。
14.权利要求13的药物组合物，进一步包含与所述抗体联合能有效治疗所述癌症量的化学治疗剂、癌疫苗、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗血管剂、信号转导抑制剂、抗增生剂、调亡诱导物和存活途径抑制剂。
15.能有效治疗哺乳动物癌症量的人抗CTLA-4抗体在制备治疗所述癌症的组合物中的应用，其中所述癌选自肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病包括急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤，以及所述癌的组合。
全文摘要
抗CTLA－4抗体，尤其是人抗CTLA－4抗体，如具有抗体3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、11.2.1、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1和12.9.1.1的氨基酸序列的那些，用于治疗某些癌症。
文档编号C07K16/18GK1404876SQ02120349
公开日2003年3月26日 申请日期2002年5月23日 优先权日2001年5月23日
发明者D·C·汉森, E·E·米勒 申请人:辉瑞产品公司