专利名称：蔓越莓中提取原花青素的方法
技术领域：
本发明涉及一种从蔓越莓中提取原花青素的方法。
技术背景原花青素(Proanthocyanidins， PACs)是植物王国中广泛存在的一大类多酚 化合物的总称，起初统归于縮合鞣质或黄烷醇类，随着分离鉴定技术的提高和 对此类物质的深入研究，现已成为独树一帜的一大类物质，并称之为原花青素。 原花青素(PACs)是黄垸-3-醇(flavan-3-ols)或黄垸-3， 4-二醇的聚合物，也称 縮合鞣质。即黄烷单体通过C-C键和C-O酯键连接成的聚合物。在可食用植物 中，黄垸单体之间主要通过B型键合(B-type linkage) [C4-C8，和C4-C6]，和 A型键合(A-type linkage) [C4-C8和C2-0-C7]方式连接聚合，聚合度可为二 聚体、三聚体、直至十聚体以上。原花青素(PAs)己被证实具有多种生物学功 能，如抗细菌黏附性、抗氧化性、抗肿瘤性等，具有广阔的应用前景。原花青素广泛存在于天然植物中，如葡萄、沙棘、松树皮及越橘类植物中。 目前报道的原花青素分离提取方法多针对我国产量较高的植物，如葡萄、松树 皮等。其中蔓越莓虽原产于北美，但目前已在我国培育成功，其产业化种植指 曰可待；另外我国也有其他越橘类植物的天然资源，因此从越橘类植物，尤其 是蔓越莓中提取原花青素有广阔的市场前景。并且越橘类植物中的原花青素由 于其独特的结构，尤其是其所具有的A型键合(A-type linkage)结构，使具有 较强的抗黏附作用。但目前针对越橘类植物，尤其是蔓越莓，提取分离原花青 素的报道较少，已有的也要经过复杂的分离提取过程。如发明专利(专利号96192723.2)和文献(Phytochemistry, 2005(66):228L)所述，前者使用蔓越莓果 粉分离原花青素，需经过繁琐的原料处理过程，二者都需经两次柱层析，成本 高、过程复杂。本发明的目的是提供一种工艺流程简单、生产成本低且易于产业化的从蔓 越莓中提取原花青素的方法。本发明的方法包括如下步骤(1) 原料处理，制得蔓越莓提取液。本发明中，所述的原料可采用蔓越莓果或其他蔓越莓原料品，如商品化的蔓 越莓浓縮汁。当采用蔓越莓果为原料时，可采用的原料处理的步骤为将蔓越莓果在溶剂 中进行研磨，再去除果肉，再蒸干溶剂，将提取物溶于水，即可。其中，所述的溶剂较佳的为含有丙酮，甲醇和柠檬酸的溶液，较佳的配比， 体积百分比70%丙酮、体积百分比30%甲醇，0.1g/100ml柠檬酸；所述的蔓越莓果与溶剂的重量体积比较佳的为2克l毫升 5克l毫升；所述的研磨的时 间较佳的为2 15分钟；所述的研磨较佳的在4 30°C下进行；所述的去除果肉 的方式可为离心后取上清液，或通过筛网过滤。当采用蔓越莓浓縮汁为原料时，可采用的原料处理的步骤为将蔓越莓浓 縮汁用水稀释。所述的水的用量较佳的为蔓越莓浓縮汁体积的0.3~3倍。(2) 将蔓越莓提取液进行脱脂处理。本发明中，所述的脱脂处理的方式可采用常用方法，如热脱脂、溶剂脱脂 及超临界流体萃取等。较佳的采用溶剂脱脂在蔓越莓提取液中加入脂溶性有 机溶剂进行脱脂处理，之后蒸干，得蔓越莓提取物。其中，所述的脂溶性有机溶剂较佳的为石油醚；所述的蔓越莓提取液与脂 溶性有机溶剂的体积比较佳的为1: 1~1: 3;所述的脱脂处理的时间较佳的为 1~3小时，次数较佳的为2 3次。(3)采用柱层析法进行分离提纯，即可。本发明中，所述的柱层析法较佳的采用凝胶柱层析法，其具体实验步骤可为1) 用平衡液将凝胶层析柱平衡。其中，所述的凝胶层析柱可使用Pharmacia公司的LH-20柱；所述的平衡 液较佳的为体积百分比50%的乙醇水溶液；平衡时间较佳的为过夜。其中，所述的凝胶层析柱中凝胶的使用量较佳的为当原料采用蔓越莓果时，凝胶与蔓越莓果的重量比为1: 20~1: 50;当原料采用蔓越莓浓縮汁时， 凝胶与蔓越莓浓縮汁的体积重量比为1克1毫升 1克:5毫升。2) 将蔓越莓提取物溶于溶剂，上样。其中，所述的溶剂较佳的为平衡液。其中，将蔓越莓提取物溶于溶剂后，较佳的将其充分旋涡振荡，再上样。3) 洗漆液洗柱，至洗涤液无色为止。其中，所述的洗涤液较佳的为体积百分比50%的乙醇水溶液；所述的洗涤液洗柱的流速较佳的为0.5 ~ 5毫升/分钟。4) 洗脱液洗柱，并收集洗脱液，即可。其中，所述的洗脱液较佳的为丙酮水溶液，较佳的混合比例为体积百分比 70%丙酮和体积百分比30%水；所述的洗脱液的用量较佳的为2~8倍的柱体积； 所述的洗脱液洗柱的流速较佳的为0.5 ~ 5毫升/分钟。本发明中，在步骤(3)釆用柱层析法进行分离提纯后，可将所得洗脱液蒸 干，即得固体原花青素。本发明的积极进步效果在于本发明工艺流程简单、生产成本低，易于产业化。本发明方法所得的原花青素可用于食品、化妆品、保健食品、医药等的 制备。本发明的原料和所用试剂均市售可得。
图1为标准品儿茶素和表儿茶素在280nm的高效液相色谱图，其保留时间分别 为第9分钟(儿茶素)，第14分钟(表儿茶素)。图2是实施例1分离产物在280nm的高效液相色谱图，显示不同聚合度的原花 青素在不同保留时间的吸收峰，主要在第18分钟左右。雄錢诚下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所 述的实施例范围之中。实施例l从蔓越莓中提取原花青素的方法1. 原料处理将200克蔓越莓果在50ml溶剂中4。C研磨5分钟(溶剂为体积百分比70% 丙酮，体积百分比30%甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，离心后取上清液，将果肉除 去，再将溶剂蒸千，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。2. 溶剂脱脂在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复一次，每次3小时。 将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发千燥，得蔓越莓提取物。3. Sephadex LH-20凝胶柱层析分离提纯将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇水溶液平衡过夜；将蔓越莓提取物溶于体积百分比50%乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上样(IO 克LH-20凝胶，柱体积为40ml);用体积百分比50%乙醇水溶液洗柱，流速为 2.5ml/min，直到流出的洗涤液变无色，弃洗涤液；然后用8倍柱体积的体积百 分比70%的丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻干 得到棕红色粉末。其中原花青素含量达80%。 200克原果可分离得到约95mg原 花青素。HPLC (高效液相色谱)鉴定用于校准的纯物质是儿茶素(9min),表儿 茶素(14min)(图1 )。图2是实施例1分离产物在280nm的高效液相色谱图，显 示不同聚合度的原花青素在不同保留时间的吸收峰，主要存在于第18分钟。色谱柱C18亲脂性柱流动相A: 0.4%磷酸，；B: 95%甲醇和5%0.4%磷酸；流量lml/min; 进样量10ul; 柱温30°C; 检测波长280nm;洗脱梯度0—38min: 79%A21%B到35°/。A65%B的双溶剂线性梯度； 38—60min: 35%A65%B; 60-70min: 100°/。的甲醇。 实施例2从蔓越莓中提取原花青素的方法1.原料处理将200克蔓越莓果在100ml溶剂中25°C研磨5分钟(溶剂为体积百分比70%丙酮，体积百分比30%甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，筛网过滤将果肉除去， 再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。2. 溶剂脱脂在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次1小时。 将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。3. SephadexLH-20凝胶层析将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇平衡过夜，将 蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50%乙醇后立即上样(10克LH-20凝胶， 柱体积为40ml);用体积百分比50%乙醇洗柱，流速为lml/min,直到流出的洗 脱液变无色，弃洗涤液；然后用3倍柱体积的体积百分比70%丙酮洗脱，收集 洗脱液；用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其中原花青素含 量达卯％。 200克原果可分离得到约70mg原花青素。 实施例3从蔓越莓中提取原花青素的方法1. 原料处理将蔓越莓浓縮汁10ml (市购)，加水稀释至25ml，制得蔓越莓提取液。2. 溶剂脱脂在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复一次，每次1小时。 将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。3. SephadexLH-20凝胶层析将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇平衡过夜，将 蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50%乙醇，旋涡震荡后立即上样(10克 LH-20凝胶，柱体积为40ml);用体积百分比50%乙醇洗柱，流速为2.5ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用8倍柱体积的体积百分比70%丙 酮洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉末。其 中原花青素含量达83%。 10ml浓縮汁中提取分离得到约30mg原花青素。 实施例4从菓越莓中提取原花青素的方法1. 原料处理-直接使用蔓越莓浓縮汁10ml (市购)，加水稀释至13ml。2. 溶剂脱脂加等体积石油醚进行脱脂处理，重复一次，每次1小时。将脱脂后的蔓越 莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。3. S印hadexLH-20凝胶层析将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇水溶液平衡过 夜，将脱脂后的原料溶于10ml体积百分比50。/。乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上 样(5克LH-20凝胶，柱体积为40ml)。用体积百分比50%乙醇水溶液洗柱， 流速为lml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液。然后用3倍柱体积的体 积百分比70%丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液。用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻 干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达95%。 10ml浓縮汁中提取分离得到约 20mg原花青素。实施例5从蔓越莓中提取原花青素的方法1.原料处理将200克蔓越莓果在40ml溶剂中4°C研磨15分钟(溶剂为体积百分比 70%丙酮，体积百分比30%甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，筛网过滤将果肉除去， 再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。在蔓越莓提取液中加3倍体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次3小 时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。 3. Sephadex LH-20凝胶层析将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇水溶液平衡过 夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50%乙醇水溶液，上样(4克LH-20 凝胶，柱体积为40ml);用体积百分比50%乙醇水溶液洗柱，流速为0.5ml/min， 直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用3倍柱体积的体积百分比70%丙 酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻干得到棕红色粉 末。其中原花青素含量达85%。 200克原果可分离得到约65mg原花青素。 实施例6从茧越莓中提取原花青素的方法1. 原料处理将200克蔓越莓果在100ml溶剂中30°C研磨2分钟(溶剂为体积百分比 70%丙酮，体积百分比30%甲醇，0.1g/100ml柠檬酸)，筛网过滤将果肉除去， 再将溶剂蒸干，将提取物溶于水，制得蔓越莓提取液。2. 溶剂脱脂在蔓越莓提取液中加2倍体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次1小 时。将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。3. Sephadex LH-20凝胶层析将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇水溶液平衡过 夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50。/。乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上 样(2.5克LH-20凝胶，柱体积为40ml);用体积百分比50%乙醇水溶液洗柱，流速为lml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用3倍柱体积的体 积百分比70%丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻 干得到棕红色粉末。其中原花青素雀量达75%。 200克原果可分离得到约62mg 原花青素。实施例7从蔓越莓中提取原花青素的方法1.原料处理将蔓越莓浓缩汁10ml (市购)，加水稀释至40ml，制得蔓越莓提取液。在蔓越莓提取液中加等体积石油醚进行脱脂处理，重复两次，每次2小时。 将脱脂后的蔓越莓提取液减压蒸发干燥，得蔓越莓提取物。 3. SephadexLH-20凝胶层析将LH-20柱(购自Pharmacia公司)用体积百分比50%乙醇水溶液平衡过 夜，将蔓越莓提取物溶于10ml体积百分比50o/。乙醇水溶液，旋涡震荡后立即上 样(2克LH-20凝胶，柱体积为40ml);用体积百分比50%乙醇水溶液洗柱， 流速为5ml/min，直到流出的洗脱液变无色，弃洗涤液；然后用2倍柱体积的体 积百分比70%丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪35。C蒸干溶剂，冻 干得到棕红色粉末。其中原花青素含量达64%。 10ml浓缩汁中提取分离得到约 16mg原花青素。以上实施例得到的原花青素产物，经MALDI-TOFMS (基质辅助激光解析 电离飞行时间质谱)和DI/ESI MS (电喷雾电离质谱)分析(分析条件为常规 参数)，主要为聚合度4-10的聚合物混合物，单体为儿茶素、表儿茶素、没食 子酰儿茶素和没食子酰表儿茶素，聚合方式包括B型和A型键合。
权利要求
1. 一种从蔓越莓中提取原花青素的方法，其特征在于包括如下步骤(1)原料处理，制得蔓越莓提取液；(2)将蔓越莓提取液进行脱脂处理；(3)采用柱层析法进行分离提纯，即可。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的原料处理的方式为将蔓越莓果在溶剂中进行研磨，再去除果肉，再蒸干溶剂，将提取 物溶于水即可；或用水稀释蔓越莓浓縮汁即可。
3. 如权利要求2的所述的方法，其特征在于所述的溶剂含体积百分比70%的丙酮和体积百分比30°/。的甲醇，以及0.1g/100ml柠檬酸。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的蔓越莓果与溶剂的重量体积比为2克l亳升 5克l毫升。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的溶剂脱脂处理的方式为在蔓越莓提取液中加入脂溶性有机溶剂进行脱脂处理，之后蒸干，得蔓越莓提取物。
6. 如权利要求5的所述的方法，其特征在于所述的脂溶性有机溶剂为石油醚。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的蔓越莓提取液与脂溶性有机溶剂的体积比为1: 1~1: 3。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的柱层析法为凝胶柱层析法。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的凝胶柱层析法的具体步骤为1) 用平衡液将凝胶层析柱平衡；2) 将蔓越莓提取物溶于溶剂，上样；3) 洗涤液洗柱，至洗涤液无色为止；4) 洗脱液洗柱，并收集洗脱液，即可。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的凝胶层析柱中凝胶的使用量为当原料采用蔓越莓果时，凝胶与蔓越莓果的重量比为1: 20 1: 80;当原料采用蔓越莓浓縮汁时，凝胶与蔓越莓浓縮汁的体积重量比为 l克l毫升 l克5毫升。
11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的平衡液和洗涤液为体积百分比50%的乙醇水溶液。
12. 如权利要求9所述的方法，其特征在于所述洗涤液洗柱和洗脱液洗柱的流速为0.5~5毫升/分钟。
13. 如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的洗脱液为体积百分比70%的丙酮水溶液。
14. 如权利要求9所述的方法，其特征在于所述的洗脱液的用量为2~8倍的柱体积。
全文摘要
本发明涉及一种从蔓越莓中提取原花青素的方法，包括如下步骤原料处理，制得蔓越莓提取液；再进行脱脂处理；然后采用柱层析法进行分离提纯，即可。本发明的方法工艺流程简单、生产成本低，易于产业化。
文档编号C07D311/62GK101239962SQ20071003728
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月7日 优先权日2007年2月7日
发明者彤 史, 飞 高 申请人:上海华珠生物科技有限公司