专利名称：海胆共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌活性蛋白的制备方法，特别是一种操作简单、成本低廉的海 胆共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法。
背景技术：
海胆为棘皮动物门(Echinoderma-to)海胆纲(Echinoidea)动物。目前世界上已 发现的海胆有850余种，常见的可食海胆有光棘球海胆(也称大连紫海胆)、紫海胆以及马粪 海胆，这些海胆除了食用价值之外，其所含有的糖类、蛋白质、脂肪酸等成分具有很多生物 活性，海胆中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充 分利用。
发明内容
本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低廉 的海胆共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法。本发明的技术解决方案是一种海胆共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法， 其特征在于依次按如下步骤进行
a.取干净、新鲜的海胆卵研磨后，将200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养 基上，37 °C恒温培养2天；
b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，用滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性；
c.取抑菌圈直径大于或等于10mm的菌株，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中 35°C发酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨的质量百分比分别为3% 禾口 6% ；
d.4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4°C 静置过夜，10000 r/min离心30 min,将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用至少3500道尔顿的 透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。本发明操作简单、成本低廉，从海胆共附生菌株的发酵液中所提取的抑菌活性蛋 白抑菌活性强，有较好的清除超氧阴离子活性，并对海虾无节幼体具有一定毒性，可应用于 抗肿瘤药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂和化妆品的添加剂等方面，具有产业价值。
具体实施例方式
本发明实施例依次按如下步骤进行 a.将刚打捞的新鲜海胆，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海胆 卵用研磨机充分研磨后，将200 mL研磨液均勻涂布于现有的牛肉膏蛋白胨平板培养基上， 37 °C恒温培养2天。b.挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株(82种)，用滤纸片法检 测各纯菌株的抑菌活性。
抑菌活性的检测大肠杆coli(EC)、变形杆菌Proteus vulgaris(PV)、金Jtfe葡萄 求菌 Staphylococcus aureus (SA)、产气！flif Enterobacter aerogenes (EA) 和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (BS)均采用现有的牛肉膏蛋白胨培养基，上述菌种均 可购自上海坤肯生物化工有限公司。将各菌种分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振 荡培养M h作指示菌。分别用移液枪取指示菌液100 μ L于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，用无菌三角涂 棒涂抹均勻，然后用记号笔在培养皿底部的外面将牛肉膏蛋白胨固体培养基培养皿分成六 个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取海胆共附菌株(纯菌株)发酵物样 品10 PL滴到滤纸片中央，置于37 °C培养箱中培养三天。每个纯菌株做3次重复处理，阳 性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。如其中一种菌株发酵液对枯草芽孢杆菌、变形杆菌有抑菌作用，抑菌圈平均直径 为11 mm，对该抑菌活性菌株利用16SRNA分子鉴定确定其为芽孢杆菌属，通过耐盐性试验、 对溶菌酶抗性试验、V. P实验、苯丙氨酸、丙二酸盐实验、柠檬酸盐利用、产糊精结晶、油脂水 解、淀粉水解、二羟丙酮的形成、过氧化氢酶、酪氨酸水解、产硫化氢、明胶水解、对溶菌酶抗 性、石蕊牛乳实验、糖发酵、硝酸盐还原、产生吲哚、动力实验、卵磷脂酶、甲基红实验、酪素 水解等生理生化试验将其鉴定到种，该活性菌株为多粘芽孢杆菌(中国微生物菌种总目录 中 CFCC103;34)。C.取抑菌圈平均直径大于或等于10 mm的菌株，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液体培 养基中35°C发酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基与现有技术的区别是其中牛肉膏和 蛋白胨的质量百分比分别为3%和6% ；
d. 4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4°C 静置过夜，10000 r/min离心30 min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用至少3500道尔顿的 透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。SDS-PAGE电泳结果表明，冷冻干燥的透析袋中物为抑菌活性蛋白质。实验及结果
1.抑制植物病原菌活性的检测在无菌条件下，用移液枪移取上述多粘芽孢杆菌菌株 发酵液1.5 mL，加入到冷却至40°C左右的沙氏培养基中摇勻，使其最终体积为15 ml，凝固 后分别用孔径为0. 8 cm的打孔器取菌落边缘生长旺盛的植物病原菌菌饼接种到含有多粘 芽孢杆菌菌株发酵液的沙氏培养基平板上，每个培养皿接种1个菌饼，每种植物病原菌做3 个重复。以与培养多粘芽孢杆菌菌株相同的空白培养基加入到沙氏培养基作为对照，置于 27 ！的恒温培养箱内培养。培养7 d后，拍照测量直径，方法是按照十字交叉测量2次， 以其平均值代表菌落直径的大小。根据抑制率的计算公式纯生长量=菌落平均直径-菌 饼直径，抑制率=(对照纯生长量-处理纯生长量)/对照纯生长量进行计算。结果表明本 发明实施例中的这株菌的发酵液对植物病原菌抑制率分别为棉花枯萎72%，串珠镰刀菌 52%，毛霉菌81%，辣椒青枯88%，番茄灰霉89%，玉米早疫89%，苹果粉红92%，西瓜枯萎72%。 上述菌种均可购自上海坤肯生物化工有限公司。由此可见，该菌株发酵液具有很强的抑制 植物病原菌活性，可作为粉剂或液体制剂用于生物农药的制备。2.海虾毒性实验取本发明实施例蛋白样品(8 mg/mL)0.05mL加到3个带刻度 的试管中，再在每试管中加入约4 mL海水和10只健康的海虾无节幼体，最后用海水加至 5 mL ；取3只试管，也加入10只健康的海虾无节幼体，再用海水加至5 mL，作为空白对照。置日光灯下，24 h后计数存活海虾。每个实验重复三次。实验结果表明小虾存活率为 25.5%，而空白对照无一死亡，因此该蛋白具有一定的海虾毒性活性。海虾幼虫曾被许多活 性测试系统应用，有研究发现海虾毒性法和9KB (人鼻咽癌)细胞毒性实验呈现很好的相关 性(P = 01036, kappa = 0156)。细胞毒的ED50 —般是海虾毒LD50的1/ 10，可用海虾 毒性法代替昂贵而繁杂的体内体外抗肿瘤实验，指导对具细胞毒和3PS ( P388，体内老鼠 白血病)活性提取物的分离。海虾毒性法具快速(24h)、便宜和简单(如不需无菌操作)等 优点，实验结果表明本发明实施例所制备的蛋白质有抗肿瘤活性，可应用于抗肿瘤药物的 制备。 3.超氧阴离子自由基(02_)清除作用的测定取邻苯三酚0.1 mL于试管中，加入 PH 8. 2的Tris-HCl缓冲溶液5 mL，加入本发明实施例制备的蛋白水溶液0. 25 mL，迅速混 勻。在25°C反应15 min。使用1 cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320 nm处测吸光度 A ”并测定样液本底的吸光度值~。酶解液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下 清除率S (%) =Ao — (Ai — Aj)/AoX 100%。式中，Ao为试剂空白的吸光度值-A为样液的 吸光度值；A^为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(O2—)不能直接诱导生物和食 品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生i^enton反应产生有高活性的· 0H，因 此常用样品对超氧阴离子自由基(02_)的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸 光度值Ao为0. 361，经清除率公式S(%)= Ao- (Ai-Aj)AoXlOO计算超氧阴离子自由基 清除率。结果表明本发明实施例所制备的蛋白超氧阴离子自由基清除率高达50.3%，因此 可用作抗氧化药物的制备或食品及化妆品等抗氧化添加剂。
权利要求
1. 一种海胆共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.取干净、新鲜的海胆卵研磨后，将200mL研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养 基上，37 °C恒温培养2天；b.挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，用滤纸片法检测纯菌株的抑菌活性；c.取抑菌圈直径大于或等于10mm的菌株，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中 35°C发酵1天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨的质量百分比分别为3% 禾口 6% ；d.4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4°C 静置过夜，10000 r/min离心30 min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500 道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。
全文摘要
本发明公开一种海胆共附生菌株抑菌活性蛋白的制备方法，依次按如下步骤进行取海胆卵研磨后，将200mL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃恒温培养2天；挑取单菌落反复划线培养至纯菌株，检测纯菌株的抑菌活性；取抑菌圈直径大于或等于10mm的菌株，在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃发酵1天；4000r/min离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4℃静置过夜，10000r/min离心30min，将沉淀用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中物冷冻干燥。
文档编号C07K14/31GK102093472SQ201010592549
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者孙秋颖, 张付云, 张瑛, 李伟, 苍桂璐 申请人:大连海洋大学