专利名称：4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法
技术领域：
本发明属于小分子有机物的免疫化学生物技术领域，具体是涉及邻苯二甲酸二庚酯完全抗原制备过程中4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法。
背景技术：
邻苯二甲酸二庚酯(DHP)作为一种主要的增塑剂，用于塑料、橡胶以及化妆品、香料、印染、涂料等行业，而邻苯二甲酸二庚酯(DHP)也是一种环境雌激素，近几年来的研究发现，邻苯二甲酸二庚酯(DHP)物质对环境、生物与食品能造成污染，它可以通过饮食、呼吸和皮肤透过等途径被人体吸收，主要危害人体的雄性生殖系统，邻苯二甲酸二庚酯(DHP) 具有类雌激素活性，少量就能够对人类的生殖系统产生损害，导致睾丸萎缩、尿道下裂、降低精子活性。商品化使用的邻苯二甲酸酯约有14种，其中6种被美国EPA列为重点控制的污染物，3种被我国列为优先控制污染物名单，8种被列为世界野生动物基金会(WffF)的环境激素名单中，欧盟曾于1999年规定市场销售的PVC玩具的邻苯二甲酸酯含量不得超过0.1%。在塑料中邻苯二甲酸二庚酯(DHP)与聚烯烃类塑料分子之间由氢键或范德华力相连结，彼此保留相对独立的化学性质，当遇到油脂、唾液和温度升高时，通过咀嚼或弯曲等机械压力即可溶出。随着塑料制品的使用规模不断扩大，邻苯二甲酸二庚酯(DHP)环境激素造成的环境影响和对人类健康的慢性和长期效应，日益受到人们的关注和担忧。目前对邻苯二甲酸二庚酯(DHP)环境激素的检测主要有液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)和气液-质谱联用(GC-MS)等色谱技术，但由于色谱技术本身的限制，测定前必须进行衍生化， 使得试样的前处理十分复杂，操作繁琐，所用的仪器昂贵，而且要求有熟练的操作人员和较长的分析周期，方法的灵敏度也受到限制，难以适应对邻苯二甲酸二庚酯(DHP)环境激素的野外检测和实验室内进行大批量的筛选实验的进行等。因此，有必要制备邻苯二甲酸二庚酯人工抗原，用于进行免疫检测。文章《邻苯二甲酸二(2-丙基庚)酯的合成》(载《精细石油化工》2007年04期， 魏国峰等)以邻苯二甲酸酐和2-丙基庚醇(2-PH)为原料，以钛酸异丙酯为催化剂，合成了增塑剂邻苯二甲酸二(2-丙基庚)酯。公开号CN 101328204A (申请号200810022244. 4)的中国专利文献公开了一种邻苯二甲酸二辛酯人工抗原的制备方法，并具体公开了一种4-氨基邻苯二甲酸二辛酯的合成路线。公开号CN 101328217A (申请号200810021411. 3)的中国专利文献公开了一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法，并具体公开了一种4-氨基邻苯二甲酸二己酯的合成路线。公开号CN 101328218A (申请号200810021412. 8)的中国专利文献公开了一种邻苯二甲酸二异辛酯人工抗原的制备方法，并具体公开了一种4-氨基邻苯二甲酸二异辛酯的合成路线。邻苯二甲酸二庚酯的相对分子质量较小，不具有免疫原性，必须和大分子的载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵血清白蛋白(OVA)等偶联之后构成完全人工抗原，才能用于动物免疫。因此为了建立邻苯二甲酸二庚酯的免疫分析方法，必须制备邻苯二甲酸二庚酯完全抗原，而在制备邻苯二甲酸二庚酯完全抗原过程中要首先合成出4-氨基邻苯二甲酸
二庚酯。
发明内容
本发明的目的就是提供了一种4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法，进而制备邻苯二甲酸二庚酯完全抗原，所制备的产品可用于邻苯二甲酸二庚酯免疫分析方法研究。本发明的方案是一种4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法，步骤如下
(1)4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸中加入庚醇，搅拌条件下加入催化剂，在115-125 下搅拌回流，减压蒸去未反应的庚醇和反应生成的水，趁热倒入冰水中，在搅拌下滴加碳酸钠溶液，直到水层的PH值为6. 5-7. 2后，分离出油状物经后续处理，得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二庚酯；
(2)4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸二庚酯中加入甲苯或苯， 搅拌条件下加入还原剂，分次滴加浓盐酸，室温下反应20-40分钟后，继续加入还原剂，搅拌反应完成后，将溶液倾入冷水中，中和反应至碱性，分离出甲苯或苯层，水层再萃取一次， 合并萃取液，干燥、减压除去甲苯或苯，得到淡黄色油状液体4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(1)所述的庚醇具体是正庚醇，进一步优选的，正庚醇的用量与4-硝基邻苯二甲酸的物质的量比为2:1 3:1，优选为2.5:1。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(1)所述的催化剂为浓盐酸或浓硫酸，进一步优选的，催化剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸物质量比为1:7 2:7，优选1. 5:7。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(1)搅拌回流时间为10-13小时(优选 10. 5-12. 5小时，更优选12小时)。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(1)所述的碳酸钠溶液质量分数为10-15% (优选12-14%，更优选13%)。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(1)所述的后续处理是将所得油状物萃取， 合并萃取液，用无水硫酸钠干燥。更加优选的，萃取油状物时使用无水乙醇或二氯甲烷，萃取液经无水硫酸钠干燥后，再旋蒸除去无水乙醇或二氯甲烷。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(2)所述还原剂为锌粉、铁粉、Sn+HCl或 LiAlH4。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(2)所述中和反应使用Imol / L的氢氧化钠溶液，萃取时使用甲苯或苯，干燥时使用无水硫酸钠。所述的合成方法，优选的方案是，步骤(2)所述甲苯或苯与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为30 1 24 1 (更优选26 1)。所述的合成方法，优选的方案是，所述还原剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为3:1 2.6:1 (更优选2. 8:1)。本发明的技术优势体现在以4-硝基邻苯二甲酸为原料，与庚醇发生酯化反应， 制备4-硝基邻苯二甲酸二庚酯，在邻苯二甲酸二庚酯的苯环上引入了一个硝基，然后将硝基还原为能与蛋白质结合的活性氨基，合成出4-氨基邻苯二甲酸二庚酯，最后4-氨基邻苯二甲酸二庚酯与蛋白质结合，形成完全抗原。本发明合成路线简单，成本低，便于应用。
图1是实施例1所得4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的紫外光谱图； 图2是实施例1所得4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的紫外光谱图3是实施例1所得邻苯二甲酸二庚酯完全抗原(DHAP- BSA)的紫外光谱图。
具体实施例方式下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。实施例中所用原料皆可从市场购买，比如，4-硝基邻苯二甲酸购自济南恒化科技有限公司；所用庚醇为正庚醇(CAS号111-70-6，无色粘稠液体。熔点-34. 1°C，沸点 176°C，155.6°C (53. 3kPa)。)，购自济南恒化科技有限公司；锌粉、铁粉、锡粒购自天津试剂三厂；HC1、硼酸钠购自莱阳精细化工厂；BSA购自北京拜尔迪生物技术有限公司。实施例1 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法
(1) 4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成在15g4-硝基邻苯二甲酸中加入30ml庚醇，在搅拌的条件下加入1. 3ml浓硫酸作为催化剂，温度控制在120°C，搅拌回流12小时后，减压除去未反应的庚醇和反应生成的水。趁热倒入冰水中，在玻璃棒搅拌下，滴加质量分数为 10%的碳酸钠溶液，直到水层的PH值为中性后，分离出油状产物，油状物用无水乙醇萃取， 合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，然后旋蒸除去乙醇，得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二庚酯9. 75g。4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的核磁共振鉴定
1H NMR (300 MHz, CDCl3), δ :8.61(d，lH，J=2. 4Hz, Ar-H) ,8. 38 (dd, 1H, J=8. 4Hz, J=2. OHz, Ar-H), 7. 84 (d, 1H, J=8. 4Hz, Ar-H), 4. 35(t，4H，J=6. 8Hz, OCH2)，1. 75(m，4H， OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，1. 25-1. 41 (m, 16H, OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，0. 87 (m, 6H, J=7. 3 Hz,
CH3)。图1是实施例所得4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的紫外光谱图，由此图可以看出 4-硝基邻苯二甲酸二庚酯(4-DHNP)最大紫外吸收波长为λ = 262nm。(2) 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的制备取1.8g4_硝基邻苯二甲酸二庚酯中加入 50ml甲苯，在搅拌条件下加入2. 4g纯锌粉。分次滴加6ml浓盐酸，室温下反应半小时后， 继续加入2. 4g纯锌粉，室温搅拌12个小时后，反应完成后，将溶液倾入80ml冷水中，用 Imol / L的氢氧化钠溶液中和至碱性。用分液漏斗分离出甲苯层，水层用20ml甲苯再萃取一次，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，减压除去甲苯，得到淡黄色油状液体1. 44g4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的核磁共振鉴定
1H 匪R (300 MHz, CDCl3), δ :7·71 (d，lH，J=8. 4Hz, Ar-H),6. 71(d,1H, J=6. 4Hz, Ar-H), 6. 67 (dd, 1H, J=8. 4Hz, J=2. 4Hz, Ar-H), 4. 27 (t，2H，J=7. 2Hz, OCH2)，4. 21 (m，4H， OCH2, NH2)，1. 70 (m, 4H, OCH2CH2)，1. 25-1. 4 (m, 16H, OCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，0. 88 (t,6H, J=6. 8Hz, CH3)。图2是实施例1所得4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的紫外光谱图，由此图可以看出 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯(4-DHAP)最大紫外吸收波长为λ = 280nm。通过比较图1、图2，可见4-硝基邻苯二甲酸二庚酯(4-DHNP)最大紫外吸收波长为λ = 262nm，4-氨基邻苯二甲酸二庚酯(4-DHAP)最大紫外吸收波长为λ = 280nm，合成物中苯环上的硝基还原为氨基后，其吸收峰红移。由核磁数据及紫外光谱分析可判定成功合成了半抗原衍生物。所得4-氨基邻苯二甲酸二庚酯可用于邻苯二甲酸二庚酯完全抗原的制备。邻苯二甲酸二庚酯完全抗原的制备取0. 5g 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯溶于4ml lmol/L的盐酸中，放置冰水浴中冷却，搅拌并保持混合物的温度在4°C以下，避光条件下，滴入5ml 0. lmol/L亚硝酸钠的水溶液，并随时补充冰块以保持溶液温度为4°C，继续搅拌反应 30min，然后，向反应体系中逐渐加入20ml溶有IOOmgBSA的硼酸钠缓冲溶液，pH值为9. 2， 反应逐渐有橙红色溶液出现，继续反应2小时，得到抗原粗产品。将反应液装入透析袋中， 置中性二次蒸馏水中透析5天，每天换水3次，将得到的橙红色产品，冷冻干燥冻存。硼酸钠缓冲溶液称取硼酸3. 09g,加入0. Imol/LNaCI溶液500ml中溶解，再加 0. Imol/LNaOH 溶液调试到 pH=9. 2。透析袋前处理剪取15cm的透析袋，在2%NaHC03和0. Imol/LEDTA (PH=8. 0)的混合溶液中煮沸10分钟，然后用蒸馏水彻底清洗，再放入0. lmol/LEDTA (PH=8. 0)的溶液中煮沸10分钟，冷却后存放于4°C溶液中备用，必须确保透析袋始终浸没在溶液中，使用前用去离子水冲洗干净。图3是所得邻苯二甲酸二庚酯完全抗原(DHAP- BSA)鉴定的紫外光谱图，由此图可以看出在280nm处都有特征吸收峰，图谱中BSA的浓度与DHAP- BSA中BSA部分的浓度一致，而DHAP- BSA完全抗原的吸光度比BSA与4-DHAP曲线的吸光度大，由吸光度的加和性，从而判定交联成功。实施例2 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法
(1)4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸中加入正庚醇，正庚醇的用量与4-硝基邻苯二甲酸的物质的量比为2:1。搅拌条件下加入催化剂浓盐酸，催化剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸物质量比为1:7。在115°C下搅拌回流，搅拌回流时间为10小时。减压蒸去未反应的庚醇和反应生成的水，趁热倒入冰水中，在搅拌下滴加质量分数为 15%的碳酸钠溶液，直到水层的pH值为6. 5后，分离出油状物经后续处理，得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二庚酯；
(2)4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸二庚酯中加入甲苯，甲苯与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为30:1。搅拌条件下加入还原剂铁粉。还原剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为3:1。分次滴加浓盐酸，室温下反应40分钟后，继续加入还原剂，搅拌反应完成后，将溶液倾入冷水中，使用Imol / L的氢氧化钠溶液行中和反应至碱性，分离出甲苯层，水层再使用甲苯或苯萃取一次，合并萃取液，使用无水硫酸钠干燥、减压除去甲苯或苯，得到淡黄色油状液体4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。实施例3 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法
(1)4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸中加入正庚醇，正庚醇的用量与4-硝基邻苯二甲酸的物质的量比为3:1。搅拌条件下加入催化剂浓硫酸，催化剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸物质量比为2:7。在125°C下搅拌回流搅拌回流时间为13小时。减压蒸去未反应的庚醇和反应生成的水，趁热倒入冰水中，在搅拌下滴加质量分数为12 的碳酸钠溶液，直到水层的PH值为7. 2后，分离出油状物经后续处理，得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二庚酯；
(2) 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸二庚酯中加入苯，苯与 4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为24:1。搅拌条件下加入还原剂LiAlH4。还原剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为2. 6:1。分次滴加浓盐酸，室温下反应30分钟后，继续加入还原剂，搅拌反应完成后，将溶液倾入冷水中，使用Imol / L的氢氧化钠溶液行中和反应至碱性，分离出苯层，水层再使用甲苯或苯萃取一次，合并萃取液，使用无水硫酸钠干燥、减压除去甲苯或苯，得到淡黄色油状液体4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。实施例4 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法
(1)4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸中加入正庚醇，正庚醇的用量与4-硝基邻苯二甲酸的物质的量比为2. 5:1。搅拌条件下加入催化剂浓盐酸，催化剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸物质量比为1.5:7。在120°C下搅拌回流搅拌回流时间为12 小时。减压蒸去未反应的庚醇和反应生成的水，趁热倒入冰水中，在搅拌下滴加质量分数为 13%的碳酸钠溶液，直到水层的pH值为7. O后，分离出油状物，将所得油状物萃取，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥。萃取油状物时使用无水乙醇或二氯甲烷，萃取液经无水硫酸钠干燥后，再旋蒸除去无水乙醇或二氯甲烷。得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二庚酯。(2) 4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸二庚酯中加入甲苯， 甲苯与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为26:1。搅拌条件下加入还原剂铁粉。还原剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为2. 8:1。分次滴加浓盐酸，室温下反应 40分钟后，继续加入还原剂，搅拌反应完成后，将溶液倾入冷水中，使用Imol / L的氢氧化钠溶液行中和反应至碱性，分离出甲苯层，水层再使用甲苯或苯萃取一次，合并萃取液，使用无水硫酸钠干燥、减压除去甲苯或苯，得到淡黄色油状液体4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。
权利要求
1.一种4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法，其特征是，步骤如下(1)4-硝基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸中加入庚醇，搅拌条件下加入催化剂，在115-125 下搅拌回流，减压蒸去未反应的庚醇和反应生成的水，趁热倒入冰水中，在搅拌下滴加碳酸钠溶液，直到水层的PH值为6. 5-7. 2后，分离出油状物经后续处理，得到黄色油状液体4-硝基邻苯二甲酸二庚酯；(2)4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成在4-硝基邻苯二甲酸二庚酯中加入甲苯或苯， 搅拌条件下加入还原剂，分次滴加浓盐酸，室温下反应20-40分钟后，继续加入还原剂，搅拌反应完成后，将溶液倾入冷水中，中和反应至碱性，分离出甲苯或苯层，水层再萃取一次， 合并萃取液，干燥、减压除去甲苯或苯，得到淡黄色油状液体4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(1)所述的庚醇具体是正庚醇，优选的，正庚醇的用量与4-硝基邻苯二甲酸的物质的量比为2:1 3:1，优选为2.5:1。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(1)所述的催化剂为浓盐酸或浓硫酸，优选的，催化剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸物质量比为1:7 2:7，优选1.5:7。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(1)搅拌回流时间为10-13小时 (优选10. 5-12. 5小时，更优选12小时)。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(1)所述的碳酸钠溶液质量分数为 10-15% (优选 12-14%，更优选 13%)。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(1)所述的后续处理是将所得油状物萃取，合并萃取液，用无水硫酸钠干燥，更加优选的，萃取油状物时使用无水乙醇或二氯甲烷，萃取液经无水硫酸钠干燥后，再旋蒸除去无水乙醇或二氯甲烷。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(2)所述还原剂为锌粉、铁粉、 Sn+HCl 或 LiAlH4。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(2)所述中和反应使用Imol/ L 的氢氧化钠溶液，萃取时使用甲苯或苯，干燥时使用无水硫酸钠。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，步骤(2)所述甲苯或苯与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为30:1 24:1 (优选26:1)。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征是，所述还原剂的用量与4-硝基邻苯二甲酸二庚酯质量的比例为3 1 2. 6 1 (优选2.8:1)。
全文摘要
本发明公开了一种4-氨基邻苯二甲酸二庚酯的合成方法，以4-硝基邻苯二甲酸为原料，与庚醇发生酯化反应，制备4-硝基邻苯二甲酸二庚酯，在邻苯二甲酸二庚酯的苯环上引入了一个硝基，然后将硝基还原为能与蛋白质结合的活性氨基，合成出4-氨基邻苯二甲酸二庚酯。本发明合成路线简单，成本低，便于应用。
文档编号C07C229/62GK102225901SQ20111011494
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者宋于燕, 庞玉波, 张霞, 王术皓 申请人:聊城大学