专利名称：一种海蜇中糖蛋白提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种糖蛋白的提取纯化方法，具体的说是一种海蜇中糖蛋白提取纯化方法。
背景技术：
海洋生物活性物质的研究是开发利用海洋资源的一个研究热点，海洋生物的多样性和特异性，为人类提供种类繁多、结构新颖、活性特异的天然产物。迄今为止，人类已从各类海洋生物中分离获得一万余种化合物，其中近二分之一具有各种生物活性。海洋是人类获得药物、功能性食品、生物材料、食品的巨大宝库。海蜇是一种医食同源的大型食用水母，具有较高的营养价值和药用价值。海蜇低糖低脂高蛋白，所以是一种天然保健食品。现代医学研究表明海蜇具有降血压、降血脂、预防动脉粥样硬化、美容护肤等功效。由于海蜇含水量高，易自溶等特点，因此对其研究前期主要集中在毒素方面。但随着科学技术和现代仪器分析手段的不断进步，对于海蜇体内活性成分的研究越来越多，如毒素、多糖、糖胺聚糖、胶原蛋白、胶原多肽、糖蛋白等，并对他们的生物活性进行深入研究。但关于用氯化钠提取海蜇糖蛋白并对其分离纯化的研究未见报道。糖蛋白的提取方法有水提取、醇提取、稀盐溶液或缓冲液提取、酸碱溶液提取和酶解法提取等方法；如从甘薯中用水提醇沉的方法制备糖蛋白。用酶法从鱿鱼喉软骨中分离纯化鱿鱼软骨素糖蛋白。用缓冲液方法从马氏珍珠贝肉中分离糖蛋白，不同的提取分离方法得到的糖蛋白组分各有差异，任国艳等人在以前的研究中，曾经用磷酸盐缓冲液从海蜇头中获得一种免疫活性糖蛋白，但其分子量较大，对糖蛋白结构特点的研究十分不利。
发明内容
为解决现有技术从海蜇中得到的糖蛋白分子量大的问题，本发明提供了一种海蜇中糖蛋白提取纯化方法，获得分子量较低的均一组分的海蜇糖蛋白，并对其进行分离纯化。本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为一种海蜇中糖蛋白提取纯化方法，包含以下步骤
1)用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，取组织捣碎液，按每克组织捣碎液加入細1浓度为 0. 3-0. 7mol/L的NaCl溶液的比例加入NaCl溶液混合均勻，在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/min的条件下离心 20min，取上清液，备用；
2)将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇的质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，然后在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；
3)使用DEAE-52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6X40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体操作为
取步骤2)中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为lmol/LNaCl 溶液进行连续梯度洗脱，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控， 当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；
4)使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6X60cm，内填物为 Blue-Sepharose 6FF，具体操作为
取步骤3)中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得纯化后的白色絮状糖蛋白。本发明所述的冻干操作为常规操作，可在任意型号的冻干机中进行。采用本发明制得的海蜇糖蛋白，性能特性如下
⑴感官白色疏松絮状纤维结晶体，极易吸潮，吸潮后容易结块；
⑵溶解性易溶于水，不溶于乙醇，丙酮等有机溶剂；
⑶显色反应
硫酸一苯酚显色
硫酸一蒽酮显色
考马斯亮蓝反应显色
菲林试剂反应显色
用高效液相色谱法，对提取出的海蜇糖蛋白纯度进行检测，用紫外检测仪和示差检测仪同时监测，结果显示在两张图谱的相同保留时间处，均出现了单一的峰，且峰型良好，左右对称，证明了分离出的海蜇糖蛋白是均一组分，经检测分析，糖含量为18. 34%，氨基酸含量75. 78%，纯度在94%以上。本发明提供了一种新的方法从海蜇中提取糖蛋白，并对其进行分离纯化。该方法能有效地将含水量大、易自溶的海蜇中的糖蛋白提取纯化，海蜇糖蛋白的分离纯化可为深入研究该新颖糖蛋白的结构特点和生物活性，开拓其在医药、功能性食品、化妆品等方面的应用，进而高附加值开发利用海蜇提供实用有效方法。有益效果本发明用氯化钠提取液从新鲜海蜇原料里提取糖蛋白，获得了一种与以往从海蜇体内提出的糖蛋白不同的新的糖蛋白，采用中空纤维膜进行浓缩，与传统的旋转蒸发浓缩法比较，具有可低温、大量、快速浓缩，且具有去除小分子杂质的作用；后续采用离子交换和凝胶柱层析，洗脱液均为双蒸水，减少后续脱盐的工序，提高了提取纯化得效率。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。实施例一
称取新鲜海蜇绞碎液lOOOg，加入浓度为0. 3mol/L NaCl溶液4000ml在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/min的条件下离心20min，取上清液；上清液再用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇的质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，然后在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干得到
0.58g粗糖蛋白干粉；重复上面步骤，获得足够量的糖蛋白。实施例二
称取新鲜海蜇绞碎液lOOOg，加入浓度为0. 5mol/L NaCl溶液4000ml在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/min 的条件下离心20min，取上清液；上清液再用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇的质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，然后在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干得到
1.23g粗糖蛋白干粉；重复上面步骤，获得足够量的糖蛋白。实施例三
称取新鲜海蜇绞碎液lOOOg，加入浓度为0. 7mol/L NaCl溶液4000ml在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/min 的条件下离心20min，取上清液；上清液再用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇的质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，然后在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干得到 1.20g粗糖蛋白干粉；重复上面步骤，获得足够量的糖蛋白。实施例四
称取新鲜海蜇绞碎液lOOOg，加入浓度为0. 5mol/L NaCl溶液4000ml在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/min 的条件下离心20min，取上清液；上清液再用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇的质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，然后在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干得到 1.23g粗糖蛋白干粉；重复上面步骤，获得足够量的糖蛋白。称取5g上面提取的糖蛋白干粉，用5ml双蒸水溶解，使用DEAE-52纤维素柱层析， 所用层析柱规格为1. 6 X 40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体操作为
称取粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为lmol/LNaCl溶液进行连续梯度洗脱，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白；
使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6X60cm，内填物为 Blue-Sepharose 6FF，具体操作为
取上述初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为 0. 5ml/min,每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，获得组分单一的糖蛋白。经检测分析，糖含量为18. 34%，氨基酸含量75. 78%，纯度在94%以上。
权利要求
1. 一种海蜇中糖蛋白提取纯化方法，其特征在于，包含以下步骤1)用组织捣碎机将新鲜海蜇绞碎，取组织捣碎液，按每克组织捣碎液加入細1浓度为 0. 3-0. 7mol/L的NaCl溶液的比例加入NaCl溶液混合均勻，在10°C的条件下置于恒温摇床内提取10h，然后取出送入离心机中，在温度为4°C、离心转速为4000r/min的条件下离心 20min，取上清液，备用；2)将步骤1中的上清液用中空纤维素膜浓缩到原体积的1/20，在浓缩后的上清液中边搅拌边加入质量浓度为95%的乙醇，当溶液中乙醇的质量浓度达75%时，停止加入乙醇，静置池，然后在离心转速为lOOOOr/min的条件下离心15min，取沉淀物冻干即为粗糖蛋白，备用；3)使用DEAE-52纤维素柱层析，所用层析柱规格为1.6X40cm，内填物为DEAE-52纤维素，具体操作为取步骤2)中制得的粗糖蛋白5g，加5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，用浓度为lmol/LNaCl 溶液进行连续梯度洗脱，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控， 当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过3h，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，透析，冻干，得到白色絮状初步纯化的糖蛋白，备用；4)使用凝胶柱层析法进一步分离纯化，所用层析柱规格为1.6X60cm，内填物为 Blue-Sepharose 6FF，具体操作为取步骤3)中得到的初步纯化的糖蛋白5g，用5ml蒸馏水溶解，过膜，上样，洗脱液为双蒸水，流速为0. 5ml/min，每管收集2. 5ml的收集液，用紫外检测仪监控，当紫外图谱上的谱线恢复到基线位置超过池，则层析结束，隔管检测糖含量，合并蛋白峰和糖峰重叠的收集液，冻干，得纯化后的白色絮状糖蛋白。
全文摘要
一种海蜇中糖蛋白提取纯化方法，新鲜海蜇绞碎后的组织捣碎液中加入氯化钠溶液提取，然后用中空纤维素薄膜浓缩，浓缩后加入乙醇，将产生的沉淀物冻干得到粗糖蛋白，得到的粗糖蛋白再一次用DEAE纤维素离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化，收集洗脱液冻干得到纯化的海蜇糖蛋白。本发明用氯化钠提取液从新鲜海蜇原料里提取糖蛋白，获得了一种与以往从海蜇体内提出的糖蛋白不同的新的糖蛋白，采用中空纤维膜进行浓缩，与传统的旋转蒸发浓缩法比较，具有可低温、大量、快速浓缩，且具有去除小分子杂质的作用；后续采用离子交换和凝胶柱层析，洗脱液均为双蒸水，减少后续脱盐的工序，提高了提取纯化得效率。
文档编号C07K1/36GK102432669SQ201110403339
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者任国艳, 刘志龙, 康怀彬, 李道敏, 梁旺春, 樊金玲, 郭金英, 陈秀金 申请人:河南科技大学