专利名称：高纯度白鲜碱单体的制备方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成分的分离纯化方法，具体为从中药白鲜皮中分离制备高纯度白鲜碱单体的方法。
背景技术：
白鲜皮为芸香科植物白鲜(Mictrnms dasycarpus Turcz.)的根皮，具有清热燥湿、祛风解毒等功效，可用于治疗湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹、皮肤搔痒、疥癣、黄疽和急慢性肝炎等疾病。白鲜碱(Dictamnine)为白鲜皮的主要化学成分，具有强心、收缩平滑肌、松弛血管、抗真菌、DNA光毒性、抗血小板聚集、昆虫拒食等作用，并且是一种潜在的保鲜剂。
OCH3
Z、丫人丫八、目前国内尚未有对白鲜碱单体进行分离的专利，现有关于白鲜碱单体分离制备的文献方法主要采用反复硅胶柱层析和kphadex LH-20凝胶柱色谱，其局限性是费时费力、 污染环境、样品纯度低，而且反复柱层析对样品有不可逆性吸附作用，分离得到白鲜碱单体制备效率低、成本较高，难以发展成为制备量大的分离技术。高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography, HSCCC )是近 30 年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，使用其它液相色谱法进行制备型分离时，其分配效率会显著降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
发明内容
本发明的目的是将柱色谱层析和高速逆流色谱法有机的结合在一起，充分发挥它们各自的优势，开发出一种制备成本低于现有技术，操作简便，效率高，可以较大批量从中药白鲜皮中，分离制备出纯度大于99%白鲜碱单体的分离制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案来实现一种高纯度白鲜碱单体的制备方法，它包括以下步骤
(1)采用有机溶剂对白鲜皮进行提取，将提取液真空浓缩成浸膏，得总提取物；
(2)将所得总提取物用柱色谱单次层析，进行初步纯化，收集含有白鲜碱的组分，合并，蒸干溶剂，得白鲜碱粗分物；
(3)采用高速逆流色谱法纯化白鲜碱粗分物，分离制得纯度高于99%的白鲜碱单体。本方案的具体特点还有，步骤(1)中有机溶剂为石油醚或乙醚。柱色谱层析采用的固定相为颗粒度为50 400目的硅胶，流动相由组分A和B组成的二元混合液，A组分为石油醚；B组分为乙酸乙酯；A与B的体积比为1 10 :1。步骤(3)中高速逆流色谱法采用的精制溶剂体系由E、F、C、D四个组分构成，E组分可选自石油醚或正己烷，F组分为乙酸乙酯或者乙酸丙酯，C组分为甲醇或者乙醇，D组分为水，E、F、C、D的体积比为1 :0. 5 2 :0. 5 3 :0. 5 2。精制溶剂体系中正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 :1 :1. 2 :1。具体而言，步骤如下
1.总粗提物的制备白鲜皮药材粉碎后，用有机溶剂提取3次，过滤，滤液减压浓缩成浸膏。2.白鲜碱粗分物的获取取提取所得浸膏，进行单次硅胶柱层析，流动相用不同比例的二元混合液，A组分为石油醚；B组分为乙酸乙酯。A与B的体积比为1 10 :1。3.高速逆流色谱法纯化白鲜碱将硅胶分离的白鲜碱粗分物进行高速逆流色谱法分离，溶剂体系由四个组分构成，E组分可选自石油醚、正己烷等醚类或烷烃类，F组分可选自乙酸乙酯、乙酸丙酯等脂肪酯类，C组分可选自甲醇、乙醇等脂肪醇，D组分为水，优选正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系，E、F、C、D的体积比为1 :0. 5 2 :0. 5 3 :0. 5 2。 具体过程为配制溶剂系统，充分摇勻后静置，待分层后，将上下相分开；用泵将溶剂系统的上相注入高速逆流色谱仪的分离柱；取溶剂系统的上相和下相溶解白鲜碱粗分物样品； 开启逆流色谱仪，注入溶剂系统的下相进行平衡；溶剂系统达到流体动力学平衡后，注入样品溶液；用紫外检测器检测洗出液，根据所得的色谱图收集目标组分。4. HPLC分析及HSCCC峰的鉴定利用高效液相色谱(HPLC)分析提取物。高效液相色谱条件岛津Siim pack VP-ODS柱6 mmX250 mm)，紫外检测波长236 nm，柱温 25°C，流速1.0 mL/min，进样量10 μ L，流动相采用甲醇水=60 :40。HSCCC峰的鉴定应用Agilent 5973N质谱仪和Varian 600 MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H-NMR和13C-NMR谱的测定。本发明的优点是分离效果好、效率高、白鲜碱单体产品的纯度达到99%以上，白鲜碱单体的制备成本远低于现有技术，是一种经济、高效的从白鲜皮药材中分离制备高纯度白鲜碱单体的方法。
图1为本发明的工艺流程图；图2为实施例1的高速逆流色谱图；图3为实施例2 的高速逆流色谱图；图4为粗提物的高效液相色谱图；图5为白鲜碱单体的高效液相色谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例及附图对本发明进行说明。实施例1 如图1白鲜碱单体制备流程图所示。1.取白鲜皮药材10 kg粉碎后用石油醚回流提取3次(每次2 h)，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得到白鲜皮总提取物101. 7 g。2.将上述石油醚总提取物进行单次硅胶柱层析(8. OX 110 cm，硅胶量2 kg, 200-300目)，采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，高效液相色谱跟踪检测石油醚/ 乙酸乙酯溶剂洗脱3:1至2:1部分，合并含有白鲜碱组分，得到白鲜碱粗分物11. 2 g。3.应用高速逆流色谱分离纯化白鲜碱粗分物
溶剂系统为正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 1 :1. 2 1,高速逆流色谱仪柱体积为沈0 mL，上样量500 mg，转速800rpm，上相为固定相，下相为流动相，流速2.0 mL/min，固定相保留率65%，检测波长254 nm。具体的操作步骤是按上述溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇勻后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，上相为固定相，下相为流动相，取500 mg白鲜碱粗提物溶解于5 mL上相和5 mL下相的混合物中待用。采用北京艾美林公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为^OmL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达SOOrpm时，设置流动相流速为2. 0 mL/min,开始泵流动相，达到流体动力学平衡后，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图(图2)接收收目标成分，得白鲜碱单体245 mg, HPLC分析纯度为99. 8%0利用高效液相色谱分析分离物，液相条件岛津Siim pack VP-ODS柱(4. 6 mmX250 mm)，紫外检测波长236 nm，柱温25°C，流速1. 0 ml/min，进样量10 yL，流动相为甲醇水=60 :40ο结构鉴定对分离得到的白鲜碱应用进行Agilent 5973N质谱仪和Varian 600 MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H-NMR和13C-NMR谱的测定，所得数据如下
白色粉末，ESI-MS (positive mode), m/z 200.0 [M+H]+. 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 4.43 (3H, s, OCH3), 7.06 (1H, d, /=3.0 Hz, H_3)，7.44 (1H, t, /=7.8 Hz, H-6), 7.61 (1H, d, /=3.0 Hz, H_2)，7.68 (1H, t, /=7.8 Hz, H_7)，8.01 (1H, d, /=2.4 Hz, H-8), 8. 25 (1H, d, /=8.4 Hz, H_5). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ ppm: 143.5 (C_2)，104.7 (C_3)，118.6 (C_3a)，156.9 (C_4)，103.4 (C_4a)，122.4 (C-5), 123.7 (C-6), 129.7 (C_7), 127.6 (C_8)，145.5 (C_8a)，163.8 (C_9a)，59.0 (OCH3)。实施例2
如图1白鲜碱单体制备流程图所示。1.取白鲜皮药材10 kg粉碎后用乙醚回流提取3次(每次2 h)，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得到白鲜皮总提取物152. 4 g。2.将上述乙醚总提取物进行单次硅胶柱层析(8. OX 110 cm，硅胶量2. 5 kg, 200-300目)，采用不同比例的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，高效液相色谱跟踪检测石油醚/ 乙酸乙酯溶剂洗脱3:1至2:1部分，合并含有白鲜碱组分，得到白鲜碱粗分物12.3 g。
3.分离所选溶剂系统为石油醚乙酸乙酯乙醇水=1 :0.9 :1. I :1，其余步骤同实施例I。得到纯度为99. 6%的白鲜碱单体224 mg，高速逆流色谱分离紫外光谱图见图3。实施例3
分离所选溶剂系统为石油醚乙酸丙酯乙醇水=1 0.71 :0. 7，其余步骤同实施例 I。得到纯度为99. 2%的白鲜碱单体231 mg。实施例4
分离所选溶剂系统为正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 1 1. I 0. 9，其余步骤同实施例 I。得到纯度为99. 5%的白鲜碱单体236 mg。实施例5
分离所选溶剂系统为石油醚乙酸丙酯甲醇水=1 :0. 8 :0. 9 :0. 8，其余步骤同实施例I。得到纯度为99. 2%的白鲜碱单体221 mg。实施例6
分离所选溶剂系统为正己烷乙酸乙酯乙醇水=1 :0. 9 1 1. 1，其余步骤同实施例
I。得到纯度为99. 4%的白鲜碱单体229 mg。实施例7
分离所选溶剂系统为正己烷乙酸丙酯乙醇水=1 :0. 7 :0. 9 :1. 2，其余步骤同实施例I。得到纯度为99. 5%的白鲜碱单体232 mg。
权利要求
1.一种高纯度白鲜碱单体的制备方法，其特征是它包括以下步骤(1)采用有机溶剂对白鲜皮进行提取，将提取液真空浓缩成浸膏，得总提取物；(2)将所得总提取物用柱色谱单次层析，进行初步纯化，收集含有白鲜碱的组分，合并， 蒸干溶剂，得白鲜碱粗分物；(3)采用高速逆流色谱法纯化白鲜碱粗分物，分离制得纯度高于99%的白鲜碱单体。
2.根据权利要求1所述的高纯度白鲜碱单体的制备方法，其特征是步骤(1)中有机溶剂为石油醚或乙醚。
3.根据权利要求1所述的高纯度白鲜碱单体的制备方法，其特征是柱色谱层析采用的固定相为颗粒度为50 400目的硅胶，流动相由组分A和B组成的二元混合液，A组分为石油醚；B组分为乙酸乙酯；A与B的体积比为1 10 :1。
4.根据权利要求1所述的高纯度白鲜碱单体的制备方法，其特征是步骤(3)中高速逆流色谱法采用的精制溶剂体系由E、F、C、D四个组分构成，E组分可选自石油醚或正己烷，F 组分为乙酸乙酯或者乙酸丙酯，C组分为甲醇或者乙醇，D组分为水，E、F、C、D的体积比为 1 :0· 5 2 :0· 5 3 :0· 5 2。
5.根据权利要求4所述的高纯度白鲜碱单体的制备方法，其特征是精制溶剂体系中正己烷乙酸乙酯甲醇水=1 1 :1. 2:1。
6.根据权利要求4所述的高纯度白鲜碱单体的制备方法，其特征是精制溶剂系统中石油醚乙酸乙酯乙醇水=1 0.9 1. 1 :1。
全文摘要
本发明涉及一种从中药白鲜皮中分离制备白鲜碱单体的工艺方法。它的工艺路线是(1)采用有机溶剂提取中药白鲜皮，得到总提取物；(2)总提取物用单次柱色谱层析，进行初步纯化；(3)以高速逆流色谱技术分离(2)所得样品，其溶剂系统由常温常压下处于液态的醚或烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水组分，醚或烷烃、脂肪酯、脂肪醇和水的体积比为10.5～20.5～30.5～2。由该法分离得到纯度高于99%的白鲜碱单体。本方法具有分离量大、操作简便、快速、回收率高等优点，有效降低了白鲜碱单体的制备成本。
文档编号C07D491/048GK102532147SQ20111045415
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘峰, 林小静, 王岱杰, 王晓, 耿岩玲, 赵恒强 申请人:山东省分析测试中心