一种分离纯化石杉碱甲的常压柱色谱组合法
【专利摘要】一种在常压下采用碱性氧化铝和硅胶柱色谱组合法分离纯化石杉碱甲的方法，适用于草药蛇足石杉的粗提物，其中石杉碱甲含量不低于1％。具体工艺为：先用碱性氧化铝柱分离纯化蛇足石杉粗提物，填料粒度100-200目或200-300目，干法装柱，径高比1:8～1:30，干法上样，上样比例1:10-100，氯仿一甲醇（80:1～8:1）洗脱，合并含石杉碱甲的流份，上硅胶柱继续分离。硅胶柱工艺参数：填料粒度100-200目或200-300目，湿法装柱，径高比1:8～1:30，湿法上样，上样比例1:10-100，氯仿一甲醇（80:1～8:1）洗脱。所得产物经丙酮重结晶即可获得成品。本工艺路线经济实用、便于产业化。
【专利说明】一种分离纯化石杉碱甲的常压柱色谱组合法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从草药蛇足石杉中分离高纯度石杉碱甲的方法，具体涉及一种在常压下采用碱性氧化铝和硅胶柱色谱组合法分离纯化高纯度石杉碱甲的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]石杉碱甲是我国学者从草药蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trve.)中分离得到的一种生物碱，药理试验显示它是高效、可逆、低毒性的乙酰胆碱酶抑制剂，具有提高记忆的功能。1995年，石杉碱甲在国内上市应用于治疗阿尔兹海默症(AD)，商品名哈伯因。1997年，FDA批准其作为食品添加剂或营养保健品在美国销售。
[0004]石杉碱甲在蛇足石杉中的含量仅万分之几，且蛇足石杉本身生长周期长，对生长环境要求高，不便大量人工栽培。而人工合成的制备工艺目前还无法用于工业化的放大生产，因此从植物中分离制备仍然是获得它的主要途径。
[0005]现已有一些有关石杉碱甲制备的文献报道。
[0006]《从植物中提取石杉碱甲的工艺》(中国专利，CN200610017954.9)与本发明方法最为接近。它采用提取原液经氯仿萃取后，萃取物上硅胶柱色谱分离，乙醇氯仿溶液洗脱，所得含石杉碱甲的流份经丙酮重结晶3~4次，得石杉碱甲成品。与本发明主要采用的填料碱性氧化铝相比，其全程采用的分离填料硅胶载样量明显偏小，仅为碱性氧化铝的1/4左右，而价格却是碱性氧化铝的2倍以上，生产成本显著高于本专利方法；本发明方法比上述专利多上一根色谱柱，但所获得的柱层析产物经I~2次结晶即可获得符合《中国药典》要求的成品，而上述专利需重结晶3~4次，一根色谱柱的洗脱周期为I~2天，而一次结晶的操作周期以2~3天计，上述 专利方法的生产周期却比本发明方法的只长不短，在生产时间成本上也处于劣势。
[0007]文献还报道了中低压制备色谱法、制备型高压液相色谱法、高速逆流色谱法、重结晶法或上述几种方法的综合。以上方法或是依赖于昂贵的色谱填料与仪器设备，生产成本高昂；或是样品处理量小，收率低，生产周期长，难以满足工业化生产的需要。
[0008]
【发明内容】
[0009]本发明的目的是建立一条经济实用、便于产业化的石杉碱甲制备工艺路线。
[0010]本发明通过以下技术方案实现:
本发明适用的原料为草药蛇足石杉的粗提物，其中石杉碱甲含量不低于I %。
[0011]将粗提物用乙醇或氯仿等有机溶剂溶解，拌入碱性氧化铝(100-200目)。再按重量比称取10-100倍量的碱性氧化铝(100-200目或200-300目)，干法装柱，径高比1:8~1:30。粗提物干法上样后，先用氯仿洗脱3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脱，碱性氧化铝或硅胶薄层色谱检测各流份，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸膏，称重后，用氯仿溶解成样品溶液备用。
[0012]再按重量比称取10-100倍量的硅胶(100-200目或200-300目)，氯仿浸泡过夜后，湿法装柱，径高比1:8~1:30。样品溶液湿法上样后，先用氯仿洗脱3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脱，硅胶薄层色谱检测各流份，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸骨。
[0013]上述干浸膏溶于丙酮，静置过夜后，即可获得符合《中国药典》要求的结晶成品。
[0014]分离过程所得中间产物HPLC检测的色谱条件为:ZORBAX Eclipse XDB — C18不镑钢柱(150mm X 4.6mm , 5Mm) (Agilent Technologies,美国)；流动相:甲醇一0.08mol/L醋酸铵溶液(32: 68，用冰醋酸调pH值至6.0);流速:I ml/ min ;检测波长:310 nm;柱温:30 °C。
[0015]所得成品含量测定的色谱条件遵循《中国药典》二部，为:Z0RBAX Eclipse XDB—C18 不镑钢柱(150mm X 4.6mm , 5Mm) (Agilent Technologies,美国);流动相:憐酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.72g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至2.5)—乙腈(86: 14);流速:I mL/min;检测波长:310 nm;柱温:30 °C。
[0016]本工艺中的石杉碱甲总回收率可达到80%以上，经1-2次结晶后，所得样品纯度即可符合《中国药典》的要求。
[0017]
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1石杉碱甲(Huperzine A)对照品的HPLC图谱 图2蛇足石杉粗提浸膏的HPLC图谱
图3碱性氧化铝柱层析产物的HPLC图谱 图4硅胶柱层析产物的HPLC图谱 图5石杉碱甲(Huperzine A)对照品的HPLC图谱 图6结晶成品的HPLC图谱
【具体实施方式】
[0019]本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
[0020]实施例1
取石杉碱甲含量不低于1%的蛇足石杉粗提物，用乙醇溶解，按样品/吸附剂1:1的比例拌入100-200目碱性氧化铝，得拌样浸膏。再按样品/填料重量比1:10称取200-300目的碱性氧化铝，干法装柱，径高比1:8。
[0021 ] 拌样浸膏干法上样后，先用氯仿洗脱I倍柱体积，再用氯仿-甲醇(80:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸膏，称重后，用氯仿溶解成样品溶液备用。
[0022]再按样品/填料重量比1:10称取100-200目的硅胶，氯仿浸泡过夜后，湿法装柱，径高比1:8。氯仿溶解的样品溶液湿法上样后，先用氯仿洗脱3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(80:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸膏。[0023]上述干浸膏按1:5的质量体积比溶于丙酮，4°C以下静置过夜后，即可析出符合《中国药典》要求的结晶成品。
[0024]实施例2
取石杉碱甲含量不低于1%的蛇足石杉粗提物，用甲醇溶解，按样品/吸附剂1:2的比例拌入100-200目碱性氧化铝，得拌样浸膏。再按样品/填料重量比1:50称取100-200目的碱性氧化铝，干法装柱，径高比1:15。
[0025]拌样浸膏干法上样后，先用氯仿洗脱2倍柱体积，再用氯仿-甲醇(50:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份(HPLC检测色谱图见附图3)，60°C减压浓缩成干浸膏，称重后，用氯仿溶解成样品溶液备用。
[0026]再按样品/填料重量比1:30称取200-300目的硅胶，氯仿浸泡过夜后，湿法装柱，径高比1:17.5。氯仿溶解的样品溶液湿法上样后，先用氯仿洗脱2倍柱体积，再用氯仿-甲醇(24:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份(HPLC检测色谱图见附图4)，60°C减压浓缩成干浸膏。
[0027]上述干浸膏按1:10的质量体积比溶于丙酮，4°C以下静置过夜后，即可析出符合《中国药典》要求的结晶成品(HPLC检测色谱图见附图6)。
[0028]实施例3
取石杉碱甲含量不低于1%的蛇足石杉粗提物，用甲醇溶解，按样品/吸附剂1:3的比例拌入100-200目碱 性氧化铝，得拌样浸膏。再按样品/填料重量比1:100称取100-200目的碱性氧化铝，干法装柱，径高比1:30。
[0029]拌样浸膏干法上样后，先用氯仿洗脱3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(8:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份(HPLC检测色谱图见附图3)，60°C减压浓缩成干浸膏，称重后，用氯仿溶解成样品溶液备用。
[0030]再按样品/填料重量比1:100称取200-300目的硅胶，氯仿浸泡过夜后，湿法装柱，径高比1:30。氯仿溶解的样品溶液湿法上样后，先用氯仿洗脱3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(8:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸膏。
[0031]上述干浸膏按1:20的质量体积比溶于丙酮，4°C以下静置过夜后，即可析出符合《中国药典》要求的结晶成品。
[0032]由于在不背离本发明实质内容的前提下有许多不同的实施方案，应该认识到，本发明的范围不受上述具体实施例的限制，而仅受权利要求书的限制。
【权利要求】
1.一种在常压下采用碱性氧化铝和硅胶柱色谱组合法分离纯化高纯度石杉碱甲的方法，其特征在于本发明适用的原料为草药蛇足石杉的粗提物，其中石杉碱甲含量不低于1%。
2.将权利要求1所述的粗提物用乙醇或氯仿等有机溶剂溶解，按样品/吸附剂1:1~1:3的比例拌入100-200目碱性氧化铝，得拌样浸膏，再按样品/填料重量比1:10~1:100称取100-200目的碱性氧化铝，干法装柱，径高比1:8~1:30。
3.将权利要求2所述的拌样浸膏干法上柱，先用氯仿洗脱I~3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸膏，称重后，用氯仿溶解成样品溶液备用。
4.根据权利要求3中获得的干浸膏重量，按照样品/填料重量比1:10~1:100称取100-200目或200-300目的硅胶，氯仿浸泡过夜后，湿法装柱，径高比1:8~1:30 ;将权利要求3所述的样品溶液湿法上样后，先用氯仿洗脱I~3倍柱体积，再用氯仿-甲醇(80:1~8:1)洗脱，收集到的各流份与对照品一起点样于硅胶薄层板上，用氯仿-甲醇系统展开，合并含石杉碱甲的流份，60°C减压浓缩成干浸膏。
5.将权利要求4所述的干浸膏按1:5~1:20的质量体积比溶于丙酮，4°C以下静置过夜后，即可析出符合《 中国药典》要求的结晶成品。
【文档编号】C07D221/22GK103804293SQ201210437662
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月6日 优先权日:2012年11月6日
【发明者】徐朝晖, 阮克锋, 冯怡 申请人:上海张江中药现代制剂技术工程研究中心