一种能够抗氧化的缢蛏多肽的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】一种缢蛏酶解多肽的制备方法，其特征在于步骤为：将缢蛏去壳、洗净绞碎，按料液质量比1∶1～4加水匀浆，调节pH值至7～8；加入蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.2％～0.3％，酶解温度为60～70℃，酶解时间2～6小时；酶解后灭酶处理，再离心取上清液即为酶解液；将酶解液经超滤、G-25凝胶色谱柱层析、反相高效液相色谱洗脱得到所需的缢蛏酶解多肽。本发明制备工艺简单，制得的缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，缢蛏酶解多肽对羟自由基清除率、DPPH自由清除率及氧化还原力较高，可用于体外抗氧化，本发明制备工艺简单，制得的缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，在体外有显著的抗氧化作用，对于进一步研究与开发以缢蛏酶解多肽为基础的功能性食品和药物，提高缢蛏的经济价值具有重大意义。
【专利说明】一种能够抗氧化的缢蛏多肽的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋功能食品类，具体是一种能抗氧化的海洋功能食品及其制备方法。
【背景技术】
[0002]海洋贝类资源丰富且富含许多生理活性物质，因而逐渐被广泛研究和应用。缢蛏(Sinonovacula constricta)俗名経子，属瓣觸纲、异齿亚纲、帘蛤目、灯塔蛤科、纟益経属，在我国沿海均有分布，产量较大，为我国四大养殖贝类之一[安贤惠，李联泰。缢蛏研究现状及发展前景[J].科学养鱼，2005 (I):4-6.]，缢蛏肉味鲜美，营养丰富，富含人体生命活动所需的各种必需氨基酸、不饱和脂肪酸等营养物质[李太武，林叶，苏秀榕，不同群体缢蛏营养成分的多元性分析[J]，食品科学，2008，29 (11) =548-551 ；Remacha, Trivino A，Anadon.Reproductive cycle of the razor clam Solen marginat us(Pulteney 1799)inSpain:acomparative study in three different locations[J], Journal of shellfishresearch, 2006, 25 (3):869-876 ;安贤惠，几种纟益経的营养性和健康性分析评价[J]，海洋湖沼通报,2005(4):99-103 ;李太武，林叶，苏秀榕，不同群体缢蛏营养成分的多元性分析[J]，食品科学，2008,29(11):548-551 ;林叶，苏秀榕，孙蓓等，不同种群缢蛏氨基酸及脂肪酸比较研究[J]，食品科学，2006，27 (12):675-678]。
[0003]缢蛏性寒、可补阴去邪热，治烦闷、冷痢、热痢、妇人产后虚损、虚热等症，具有较高的药用食用价值[蒋忠妙，郑国平，陈木森.舟山群岛海洋药用动物资源及民间应用的调查[J].中国海洋药物，200 2，85 (I):35.;苏晶，苏明翥编著，水产品药用巧治百病[M].沈阳:辽宁科学技术出版社，2000，187.];缢蛏的活性成分还具有较高的研究价值，如雷晓凌等[雷晓凌，吴红棉，范秀萍等，缢蛏糖胺聚糖的提取分离及其体外抗肿瘤活性的初步研究[J]，药物生物技术，2004，11(3) =146-149]，对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强。
[0004]活性多肽由于具有敏感性高、稳定性好及副作用少等优点，已被用作抗氧化药物开发的一个重要来源。研究已经证实，食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽[郑惠娜，章超桦，曹文红.海洋蛋白酶解制备生物活性肽的研究进展[J].水产科学，2008，27 (7):370.]。对于缢蛏，在抗氧化方面的研究还很少，特别是利用酶解技术提取多肽在抗氧化方面的研究并未见报道。
[0005]本研究通过正交实验确定胰蛋白酶水解缢蛏的最佳酶解条件，并研究酶解多肽的体外抗氧化活性，为该领域的进一步研究提供科学依据，并且对于进一步研究与开发以缢蛏酶解多肽为基础的功能性食品和药物，提高缢蛏的经济价值具有重大意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种缢蛏酶解多肽的制备方法，以DPPH清除率为指标，通过正交实验进行酶解，获得DPPH清除率最大的酶解条件。在此酶解条件下进行酶解，得到缢蛏酶解多肽，具有制备工艺简单、易操作等特点。
[0007]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种缢蛏酶解多肽的应用，缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，具有体外抗抗氧化的作用。
[0008]本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为:一种缢蛏酶解多肽的制备方法，其特征在于步骤为:
[0009]I)前处理:将缢蛏去壳、洗净绞碎，按料液质量比1:1~4加水匀浆，调节pH值至7~8 ; [0010]2)酶解:加入蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.2%~0.3%，酶解温度为60~70°C，酶解时间2~6小时；
[0011]3)酶解后灭酶处理，再离心取上清液即为酶解液；
[0012]4)将酶解液经超滤、G-25凝胶色谱柱层析后收集的各个洗脱峰浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用DPPH清除率进行抗氧化实验，确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；
[0013]5)最后，采用反相高效液相色谱进行洗脱纯化得到所需的缢蛏酶解多肽。
[0014]作为优选，所述步骤I)的料液质量比1: 2，pH值为8。
[0015]作为优选，所述步骤2)的蛋白酶为胰蛋白酶，蛋白酶的加入量为900U/g，酶解温度为30°C，酶解时间6小时。
[0016]作为改进，所述步骤3)的灭酶处理是在80~95°C，加热10~15min，离心是在5000 ~7000r/min 下离心 10 ~20min。
[0017]再改进，所述步骤4)的超滤是将酶解液加入超滤杯，用3KD的超滤膜进行超滤，收集3KD分子量以下的酶解液，进行冷冻干燥；
[0018]G-25凝胶色谱柱层析的具体步骤为:采用湿法装柱，柱高为80cm，直径为2.6cm,装柱完毕后用去离子水进行平衡，样品的浓度为200mg/mL，每次上样量为3mL，洗脱液为去离子水，洗脱速度为2.3mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用DPPH清除率进行抗氧化实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；
[0019]最后，所述步骤5)的反相高效液相色谱洗脱纯化的具体工艺参数为:色谱条件:C18反相柱；柱型:10 X 250mm ；乙腈/水为流动相，流速为0.8mL/min,上样体积为20 μ L，检测波长220nm ;洗脱条件:乙腈浓度为15%，洗脱20min。
[0020]本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为:一种根据上述制备方法得到的缢蛏酶解多肽在体外抗氧化的应用。
[0021]与现有技术相比，本发明的优点在于:通过正交实验确定最佳酶解条件，以DPPH清除率为指标，通过正交实验进行酶解，获得DPPH清除率最大的酶解条件。
[0022]本发明制备工艺简单，制得的缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，在体外有显著的抗氧化作用，对于进一步研究与开发以缢蛏酶解多肽为基础的功能性食品和药物，提高缢蛏的经济价值具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是S印hadex G25凝胶色谱柱峰谱图；[0024]图2是高效液相检测缢蛏酶解多肽纯度
[0025]图3是缢蛏酶解液的DPPH自由基清除率
[0026]图4是缢蛏酶解液的还原力
[0027]图5是缢蛏酶解液的羟自由基清除率
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0029]1.材料与仪器
[0030]1.1主要材料与试剂
[0031 ] 缢蛏购自浙江省舟山市南珍市场；
[0032]胰蛋白酶，美国SIGMA公司；
[0033]DPPH、邻二氮菲、硫酸亚铁、双氧水、铁氰化钾，北京亚太恒信生物科技有限公司
[0034]其余试剂均为分析纯。
[0035]1.2主要仪器
[0036]DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂；
[0037]BSA124S型电子天平，德国Sartorius AG公司；
[0038]SSW型微电脑电热恒温槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
[0039]PHS_250pH计，上海理达仪器厂；
[0040]CF16RXII高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；
[0041]752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；
[0042]LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；
[0043]2.实验方法
[0044]2.1胰蛋白酶酶解条件的优化以酶解温度A (30°C、35°C、40°C、45°C )，pH值B (7.0、
7.5、8.0、8.5)，料水比 C(1: 0、1: 1、1: 2、1: 3)，时间 D(2、4、6、8h)，加酶量E(300U/g、600U/g、900U/g、1200U/g)为因素，以DPPH为指标，通过实验数据确定最佳酶解条件，设计L9(34)正交实验。
[0045]2.2Sephadex G-25凝胶层析:将Sephadex G-25凝胶颗粒采用湿法装柱,柱高为80cm,直径为2.6cm,装柱完毕后用去离子水进行平衡。样品的浓度为200mg/ml,每次上样量为3ml，洗脱液为去离子水，洗脱速度为2.3ml/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥。将干燥后得到的各个峰组分采用DPPH清除率实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥。
[0046]2.3反相高效液相色谱(RT-HPLC)
[0047]RT-HPLC进行纯化。色谱条件:C18反相柱；柱型:10 X 250mm ；乙腈/水为流动相，流速为0.8mL/min,上样体积为20 μ L，检测波长220nm。洗脱条件:乙腈浓度为15%，洗脱20min，重复上样。
[0048]2.4酶解产物的抗氧化活性测定
[0049]2.4.1DPPH 法
[0050]向试管中加入2ml酶解液，再加入2πι120μπιΟ1/1 DPPH的乙醇溶液，震荡摇匀，室温避光反应30min后，用无水乙醇作参比在517nm处测定其吸光度As。[0051]相同条件下，取2mL20 μ mol/L的DPPH溶液与用2ml乙醇溶液混合，震荡摇匀，室温避光反应30min后，测得吸光度Ac.[0052]取2ml样品与2ml乙醇溶液混合，震荡摇匀，室温避光反应30min后，测得吸光度Ao0
[0053]其中，DPPH清除率(% ) = [1-(As-Ao)/Ac] X 100%
[0054]Ac:2ml乙醇与2mlDPPH溶液的吸光度
[0055]As:2ml样品与2mlDPPH溶液的吸光度
[0056]AO:2ml样品与2ml乙醇的吸光度。
[0057]2.4.2 羟自由
[0058]取0.5mL0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，依次加入ImL0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.40)和0.5mL去离子水，充分混匀后，加入0.5mL0.75mmol/L
[0059]硫酸亚铁溶液(FeSO4)混匀后，加入0.5mL 0.0I %双氧水(H2O2)，于37 °C水浴60min后,在536nm测定吸光度,所测得的数据为损伤管的吸光值A损。未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中0.5mL0.01 %双氧水(H202)，操作方法同损伤管，可测得536nm未损伤管的吸光值A未，样品管以0.5mL样品代替损伤管中的0.5mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得536nm样品管的吸光值A，按下式计算样品对.0H的清除率:
[0060]清除率I (% ) = (A-A 损)/ (A 未-A 损)X 100
[0061]2.4.3 还原力
[0062]在2.5ml不同浓度提取液中，加入2.5ml (0.2mol/L, pH = 6.6)的磷酸缓冲溶液，再加入2.5ml的10g/L铁氰化钾，混匀，50°C恒温20min，迅速冷却，加2.5mll0%的三氯乙酸，混匀后，离心IOmin (3000r/min),取上清液2.5ml,加2.5ml蒸懼水,再加0.5ml0.1%H氯化铁溶液，于700nm波长下检测吸光度重复三次，取平均值。吸光值越大，还原能力越强
[0063]3 结果
[0064]3.1胰蛋白酶的正交实验结果
[0065]胰蛋白酶对缢蛏进行酶解的影响因素顺序为:温度 > 加酶量 > 时间 > 料水比>PH值，最佳的酶解条件为:温度为30°C，料水比为1: 2，加酶量为900U/g，时间为6h时，对DPPH清除率最大，达到68.54%。取500缢蛏按最佳酶解条件进行酶解，进行下一步活性测试。
[0066]表1胰蛋白酶L16 (45)正交表
[0067]
【权利要求】
1.一种缢蛏酶解多肽的制备方法，其特征在于步骤为: 1)前处理:将缢蛏去壳、洗净绞碎，按料液质量比1:0~4加水匀浆，调节pH值至7.0 ~8.5 ; 2)酶解:加入蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量600U/g~1200U/g，酶解温度为30~45°C，酶解时间2~8小时； 3)酶解后灭酶处理，再离心取上清液即为酶解液； 4)将酶解液经超滤、G-25凝胶色谱柱层析后收集的各个洗脱峰浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用DPPH清除率进行抗氧化实验，确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥； 5)最后，采用反相高效液相色谱进行洗脱纯化得到所需的缢蛏酶解多肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤I)的料液质量比1:2，pH值为8。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤I)的蛋白酶为胰蛋白酶，蛋白酶的加入量为900U/g，酶解温度为30°C，酶解时间6小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的灭酶处理是在温度85~95°C下加热8~12min,离心是在4000~6000r/min下离心8~12min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)的超滤是将酶解液加入超滤杯，用3KD的超滤膜进行超滤，收集3KD分子量以下的酶解液，进行冷冻干燥。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)的G-25凝胶色谱柱层析的具体步骤为:采用湿法装柱，柱高为80cm，直径为2.6cm，装柱完毕后用去离子水进行平衡，样品的浓度为200mg/mL，每次上样量为3mL，洗脱液为去离子水，洗脱速度为2.3mL/min,蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用DPPH清除率进行抗氧化实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤5)的反相高效液相色谱洗脱的具体工艺参数为:色谱条件:C18反相柱；柱型:10X250mm ;乙腈/水为流动相，流速为0.8mL/min，上样体积为20 μ L，检测波长220nm ;洗脱条件:乙腈浓度为15%，洗脱20min。
8.一种根据权利要求1所述的制备方法得到的缢蛏酶解多肽在体外抗氧化的应用。
【文档编号】C07K1/22GK103740792SQ201310249321
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2013年6月7日
【发明者】黄芳芳, 丁国芳, 杨最素, 郁迪 申请人:浙江海洋学院