亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法
【专利摘要】本发明公开了一种亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，包括以下步骤：（1）获取重组蛋白Htt（1-90）：a.亨廷顿蛋白基因的获得；b.重组表达质粒pTWIN1-htt的构建；c.表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建；d.重组蛋白的表达；（2）重组蛋白Htt（1-90）的纯化；（3）SPPS方法获得糖基化修饰的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的纯化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽与重组蛋白Htt（1-90）经过偶联获得经糖基化修饰目的蛋白Htt（1-158）；（6）经糖基化修饰目的蛋白Htt（1-158）的纯化。通过对亨廷顿蛋白的糖基化修饰，显示出糖基化蛋白有较强的稳定性，且温度和时间对亨廷顿蛋白的吸收峰的影响，说明经糖基化修饰的亨廷顿蛋白相对稳定。
【专利说明】亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蛋白质的化学修饰，具体涉及一种亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质修饰是一个复杂的过程，在真核生物中修饰类型很多，常见的有糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白质修饰能够改变蛋白质的活性、定位或功能。蛋白糖基化对蛋白质的功能和稳定性有重要的影响，首先许多的错误折叠蛋白，对细胞活动和组织代谢产生一定影响，进而影响到器官的功能，糖基化蛋白的连接形式主要有N、O连接两种形式。蛋白结构的改变对圆二色谱吸收和抗水解酶能力有一定的影响；其次，一些糖基化蛋白有利于蛋白质的正确折叠.亨廷顿舞蹈病(Huntington disease, HD)是一种常染色体显性遗传的神经变性疾病，HD基因编码一个由3144个氨基酸组成的亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)，从Htt氨基酸末端第17位开始有一段重复的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重复序列将产生两个直接结果:一是使野生型亨廷顿蛋白(wild huntingtin, wHtt)缺失,二是产生突变型亨廷顿蛋白(mutant Htt,mHtt)。随着多聚谷氨酰胺的过度延长,Htt蛋白会在转谷氨酰胺酶的作用下发生交联而形成聚集体，在主链和侧链酰胺基之间氢键连接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，称为多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ长度小于35个，而HD患者的PolyQ长度会超过37个。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。临床表现主要为舞蹈样不自主动作、精神障碍和进行性痴呆。
[0003]没有修饰的亨廷顿蛋白显示出稳定性较差等，目前国内还没有研究所或者机构对亨廷顿蛋白进行化学修饰。通过对亨廷顿蛋白的糖基化修饰，主要是Ser和Thr的O-连接糖基化，显示出蛋白的稳定性增加，糖基化蛋白有不同的圆二色谱吸收，显示出糖基化蛋白有较强的稳定性，且温度和时间对亨廷顿蛋白的吸收峰的影响，说明经糖基化修饰的亨廷顿蛋白相对稳定，因此研究亨廷顿蛋白的糖基化对亨廷顿疾病的治疗有重要意义。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，通过对亨廷顿蛋白的糖基化修饰，主要是Ser和Thr的O-连接糖基化，显示出蛋白的稳定性增加，糖基化蛋白有不同的圆二色谱吸收，显示出糖基化蛋白有较强的稳定性，且温度和时间对亨廷顿蛋白的吸收峰的影响，说明经糖基化修饰的亨廷顿蛋白相对稳定，因此研究亨廷顿蛋白的糖基化对亨廷顿疾病的治疗有重要意义。
[0005]本发明的目的可通过下列技术方案来实现:一种亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，包括以下步骤:(1)、获取重组蛋白Htt (1-90):a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质SpTWINl-Aii的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5a-htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt (1-90)的纯化；(3)、SPPS方法获得糖基化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽；(4) Htt (Cys_K92_K158)多肽的纯化；(5) Htt (Cys_K92_K158)多肽与重组蛋白Htt (1-90)经过偶联获得经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158); (6)经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化。
[0006]作为优选，所述步骤(1)中:a、亨廷顿蛋白基因的获得:设计含有及丨和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，从质粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法扩增亨廷顿蛋白基因片段，将所扩增的Aii基因片段和克隆载体pMDlS-T载体链接，得到重组质粒，转入大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pMD18T-Aii ;b、重组表达质粒pTWINl-htt的构建:将原核表达载体pTWINl和重组质粒pMD18T-Aii分别用限制性内切酶I和Pst I双酶切，纯化处理后将线性pTWINl质粒片段和Aii基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证,所得重组质粒命名为pTWINl-Α-- ;c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建:采用电转化法将重组质粒pTWINl-Α--转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌，命名为:DH5 a -htt ;d、重组蛋白的表达:将重组菌DH5 a -htt接种至LB液体培养基，置37°C摇床过夜培养，吸取过夜培养菌体以5%接种量接种LB液体培养基，37°C摇床培养至0D600=0.5^0.7，然后置20°C摇床培养加入lmmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4~6h,离心收集菌体,在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中进行超声破碎，通过离心(23000 X g，30min，40°C)将细胞碎片和上清液分离。
[0007]进一步地，所述的步骤(3)中合成Htt (Cys-K92_K158)多肽的过程分为三个片段合成:a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；C、最后合成Cys-K92-1108片段；d、每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt(Cys-K92-K158) 多肽。
[0008]进一步地，所述步骤(3)中糖基化修饰位于亨廷顿外显子2或外显子3区域，即S95位点、T97位点、T107位点、SI 16位点、S120位点、S138位点、S143位点中的至少一个位点。
[0009]进一步地,合成Cys-K92_I108片段所用的固相载体是wang —树脂。
[0010]进一步地，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138_K158片段所用的固相载体是N-酰基-苯并咪唑酮树脂。
[0011]经糖基化修饰的亨廷顿蛋白与野生型亨廷顿蛋白比较，具有以下优点:通过对亨廷顿蛋白的糖基化修饰，主要是Ser和Thr的O-连接糖基化，显示出蛋白的稳定性增加，糖基化蛋白有不同的圆二色谱吸收，显示出糖基化蛋白有较强的稳定性，且温度和时间对亨廷顿蛋白的吸收峰的影响，说明经糖基化修饰的亨廷顿蛋白相对稳定，因此研究亨廷顿蛋白的糖基化对亨廷顿疾病的治疗有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为获得Httl-90重组蛋白的流程图；图2为S95位点糖基化修饰的Htt (Cys-K92-K158)多肽合成示意图；
图3为经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158)的合成流程图；
图4:A为HttCys-K92-K158蛋白序列和合成片段；
B为Htt (Cys-K92-K158)多肽糖基化修饰位点；
图5:为糖基化与非糖基化亨廷顿蛋白的圆二色谱比较:
A为糖基化亨廷顿蛋白的圆二色谱图；
B为非糖基化亨廷顿蛋白的圆二色谱图；
图6:为时间对糖基化亨廷顿蛋白与非糖基化亨廷顿蛋白稳定性影响的比较:
A为时间对糖基化亨廷顿蛋白稳定性分析；
B为时间对非糖基化亨廷顿蛋白稳定性分析；
图7:为温度对糖基化亨廷顿蛋白与非糖基化亨廷顿蛋白稳定性影响的比较:
A为温度对糖基化亨廷顿蛋白稳定性分析；
B为温度对非糖基化亨廷顿 蛋白稳定性分析。
具体实施例
[0013]实施例1:获得重组蛋白Httl-90 一)试验材料
(I)载体和菌株
质粒pcDNA3.Ι/mys-His由CHDI惠赠；表达载体pTWINl购自NEB公司；质粒pMD18_T和大肠杆菌JM109、DH5a购自Takara生物科技有限公司。
[0014](2)弓丨物
Pl:5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3 (EcoR I)
P2:5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3 (Pst I)
由上海生工生物工程有限公司合成。
[0015]二)实施方案
1.亨廷顿蛋白基因的获得
以质粒pcDNA3.Ι/mys-His为模板，设计合成含有I和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，PCR扩增Aii基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化处理后与载体PMD18-T连接，转入大肠杆菌JM109中，通过氨苄青霉素抗性筛选，得到重组质粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司测序。将验证后的重组质粒用丨和Pst I双酶切处理，酶切产物纯化处理后置4°C冰箱保存。
[0016]2.重组表达质粒pTWINl-Α--的构建
将原核表达载体pTWINl用限制性内切酶丨和I双酶切，纯化处理后将线性PTffINl质粒片段和Ai?基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定，得到重组质粒pTWINl-Α--。
[0017]3.表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建
采用电转化法将重组质粒pTWINl-Α--转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌DH5 a -htt。
[0018]将重组菌DH5a-Aii接种至LB液体培养基，置37°C摇床过夜培养。吸取过夜培养菌体以5%接种量接种LB液体培养基，37°C摇床培养至0D600=0.5^0.7，然后置20°C摇床培养加入lmmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4~6h,离心收集菌体。在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH=8.3 的溶液中进行超声破碎。通过离心(23000 X g, 30min, 40°C )将细胞碎片和上清液分离开来。粗多肽纯度为60%。如图1所示为获取重组蛋白Htt( 1-90)的流程图。
[0019]实施例2:重组蛋白Htt (1-90)的纯化
Httl-90-1ntein-CBD融合蛋白中CBD成分可与几丁质树脂特异结合，从而便于去除杂蛋白，随后intein成分在一定条件下催化融合蛋白在httl-90和intein之间发生断裂。具体操作如下:将上清液上样于2ml几丁质重力柱。柱子先经过A液(Na-HEPES (pH8.0)20mmol/L,NaCl 500mmol/L,EDTA lmmol/L)进行平衡，上清液上样后，再以A液洗脱。然后柱子在 B 液(Na-HEPES (ρΗ8.0)20mmol/L，NaCl 500mmol/L,EDTA lmmol/L,DTT 50mmol/L)中 40C 下浸泡 16h。C 液(Na-HEPES (pH8.0) 20mmol/L,NaCl 500mmol/L)洗脱蛋白，每 Iml收集。将每步收集到的样品进行SDS-PAGE分析，鉴定蛋白质的纯度是90%。[0020]洗脱蛋白溶液中加入含有0.25mmol/L pH7.8 MESNA的溶液，室温摇床切割3次，每次24h。收集切割液加I倍体积的HEPES Buffer慢速冲洗柱子，合并二次洗脱液，最后一次切割液加压吹干并回收树脂。将蛋白洗脱液移至超滤管，10000r/min离心15_30min，超滤至1.5ml时移液枪转移上层蛋白液，得到纯度为99%的重组多肽2g, _40°C冻存。
[0021]实施例3 =SPPS方法获得位于S95位点糖基化修饰的Htt (Cys-K92_K158)多肽 本合成过程分为三个片段，首先合成Cys-S138-K158，再合成Cys-El 10-L136，
最后合成Cys-K92-1108。每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽
固相肽的合成是在CS336X的多肽合成仪上进行的，Cys-S138-K158多肽的合成是基于Wang树脂。树脂的去保护和解聚在(TFA/DCM/H20/TIPS 90/5/2.5/2.5)溶液中能够自发进行。然后通过10倍当量的冷乙醚对其沉淀，这些原始多肽通过反相HPLC进行纯化，使用waters 600泵和waters 2489紫外/可见光检测器，柱子采用GRACE-Vydac 218TP54 C18柱。流动相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的检测波长是214nm和234nm。多肽的质量通过MALD1-T0F-MS和ES1-MSF分析。最终得到16mg、纯度为99%的Cys-S138-K158多肽，产率为45%。
[0022]Cys-El 10-L136多肽合成基于NBZ树脂，在多肽的C端产生一个NBZ衍生结构方便进行NCL反应。NBZ树脂最初的制备是通过氨基酸化的MBHA树脂和去保护的Fmoc与5倍当量的D1-Fmoc-3,4 二氨基苯甲酸偶联得到的。多肽的延长通过Fmoc保护的氨基酸，当DIPEA浓度达到0.5mol/L时，Dbz与4-硝基苯基氯甲酸酯耦合时在分子内形成环状。最后通过键的断裂得到的多肽，合成的多肽N端采用赛唑烧保护，在methoxyamine HClpH4.0条件下噻唑烷化学键断裂形成巯基。纯化步骤同上。最终得到14mg、纯度为99%的Cys-El 10-L136 多肽，产率为 52%。
[0023]Cys-K92-1108合成与E110-L136多肽合成类似，多肽的固态合成基于NBZ树脂，在多肽的C端产生一个NBZ衍生结构方便进行NCL反应。首先将糖基上的羟基乙酰化，通过化学方法与S95位的丝氨酸羟基发生化学反应，然后再与氨基Fmoc保护的L94位氨基酸NCL反应。通过固肽合成得到K92-1108-GlycoS95多肽。最后合成的多肽在N端赛唑烷保护和C端NBZ衍生结构,在methoxyamine HCl pH4.0条件下噻唑烧化学键断裂形成巯基，纯化步骤同上。最终得到10mg、纯度为99%的Cys-E110-L136多肽，产率为54%。
[0024]如图2所示为S95位点糖基化修饰的Htt (Cys-K92_K158)多肽合成示意图。
[0025]实施例4:位于S95位点经糖基化修饰的Htt (Cys-K92_K158)多肽的纯化
多肽的鉴定和纯化通过重新注入反相色谱，此时检测器是二极管阵列检测器，流动相同。流动相A是0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B是0.1%三氟乙酸乙腈溶液，多肽的检测波长是214nm和234nm。最终得到5.04mg的HttCys-K92_K158蛋白，产率为12.6%。
[0026]实施例5: Htt (Cys-K92-K158)多肽与重组蛋白Htt (1-90)经过偶联获得经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158)
将重组蛋白Httl-90和固相合成蛋白HttCys-K92-K158放入缓冲液中，利用巯基和硫酯的特异性反应，再经过由S到N的转变完成肽键的合成。其合成示意图如图3。
[0027]实施例6:经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化
NCL反应后的Httl-158产物通过反相高效液相色谱纯化，纯化柱是C0SM0SIL5C4-AR-300 (4.6mm*150mm 5 μ m)，线性梯度是10_90%，产物洗脱是在55%梯度下，得到产物
4.5mg(0.5 μ mo I, 33%)，通过MALDI计算产物的分子量。通过UPLC评定产物的纯度。纯度为99%，产率为6.3%ο
[0028]实施例7:圆二色谱分析糖基化和非糖基化蛋白的稳定性
样品的制备:样品溶解在lOmmol/L的triS-HCl、75mmol/L的NaCl、pH7.4的缓冲溶液中，在250C下用Jusco J185圆二色谱仪分析，在190_250nm范围内，平均每8_12nm收集波长，数据的获得通过以50nm/min速度进行扫描，每0.2nm得到一个圆二色谱吸收值。进而得到两种蛋白质的不同圆二色谱吸收。
[0029]如图5所示为糖基化与非糖基化亨廷顿蛋白的圆二色谱比较，糖基化修饰亨廷顿和野生型亨廷顿蛋白都是在203nm出现最低吸收峰，表现出亨廷顿蛋白具有无规则卷曲结构，37°C下，经过一段时间的培养，糖基化修饰的蛋白吸收峰信号减弱，野生型的减弱了53%，经过糖基化修饰糖蛋白减弱了 45%，表明水溶性蛋白产生凝聚和沉淀。野生型蛋白稳定性比糖基化蛋白弱。
[0030]实施例8:糖基化蛋白与非糖基化亨廷顿蛋白稳定性比较 样品制备:将样品溶解在缓冲液中，通过反相色谱柱，进行分析。
[0031]色谱条件:通过反相-高效液相色谱(RP-HPLC)，waters2795系统，C18柱(4.6πιπι*250πιπι，5μπι)。流动相A:0.1%的三氟乙酸水溶液，B是0.1%的三氟乙酸乙腈溶液。
[0032]实验结果如图所不:图6中，非糖基化蛋白大概在13min所有出峰,随着时间延长，其蛋白质量减少，非糖基化蛋白在水解酶的作用下，部分水解，Id后，吸收峰有明显的降低，尤其是在3d后，吸收峰是开始时刻的25%。主要是由于未糖基化蛋白不稳定发生凝聚，使得吸收峰降低。
[0033]图7中，糖基化予廷顿蛋白在13min左右出峰，说明糖基化对出峰时间广生了影响，不同的温度下其吸收峰有一定差别，高温条件下吸收峰降低，尤其是非糖基化蛋白。
[0034]综上所述结果说明，经糖基化修饰的亨廷顿蛋白相对比较稳定。
【权利要求】
1.一种亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)、获取重组蛋白Htt (1-90):a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWINl-Α--的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5a -htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt (1-90)的纯化；(3),SPPS方法获得糖基化修饰的Htt (Cys-K92_K158)多肽；(4) Htt(Cys-K92-K158)多肽的纯化；(5) Htt (Cys-K92_K158)多肽与重组蛋白 Htt (1-90)经过偶联获得经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158); (6)经糖基化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化。
2.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，其特征在于，所述步骤(1)中:a、亨廷顿蛋白基因的获得:设计含有I和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，从质粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法扩增亨廷顿蛋白基因片段，将所扩增的htt基因片段和克隆载体pMDlS-Τ载体链接，得到重组质粒，转入大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pMD18T-Aii ;b、重组表达质粒pTWINl-htt的构建:将原核表达载体pTWINl和重组质粒pMD18T-Aii分别用限制性内切酶I和I双酶切，纯化处理后将线性pTWINl质粒片段和Aii基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pTWINl-Α-- ;c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建:采用电转化法将重组质粒pTWINl-Α--转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌，命名为:DH5a-Aii ;d、重组蛋白的表达:将重组菌DH5 a-Aii接种至LB液体培养基，置37°C摇床过夜培养，吸取过夜培养菌体以5%接种量接种LB液体培养基，37°C摇床培养至0D600=0.5^0.7，然后置20°C摇床培养加入lmmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4~6h,离心收集菌体,在40mmol/L的TRIS_Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中进行超声破碎，通过离心(23000 X g，30min, 40°C )将细胞碎片和上清液分离。
3.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，其特征在于，所述的步骤(3)中合成Htt (Cys-K92-K158)多肽的过程分为三个片段合成:a、首先合成Cys-S138_K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；C、最后合成CyS-K92_I108片段；d、每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt (Cys-K92-K158)多肽。
4.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，其特征在于，所述步骤(3)中糖基化修饰位于亨廷顿外显子2或外显子3区域，即S95位点、T97位点、T107位点、SI 16位点、S120位点、S138位点、S143位点中的至少一个位点。
5.根据权利要求3所述的亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，其特征在于，合成Cys-S138-K158片段所用的固相载体是wang树脂。
6.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的糖基化修饰方法，其特征在于，合成Cys-El 10-L136片段和CyS-K92_I108片段所用的固相载体是N-酰基-苯并咪唑酮树脂。
【文档编号】C07K1/107GK103601797SQ201310555234
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】王喆明 申请人:杭州拜善晟生物科技有限公司